Vă mulțumim că ați vizitat Nature.com.Versiunea de browser pe care o utilizați are suport limitat pentru CSS.Pentru cea mai bună experiență, vă recomandăm să utilizați un browser actualizat (sau să dezactivați Modul de compatibilitate în Internet Explorer).Între timp, pentru a asigura suport continuu, vom reda site-ul fără stiluri și JavaScript.
Vectorii genici pentru tratamentul fibrozei chistice pulmonare trebuie să fie direcționați către căile respiratorii conductoare, deoarece transducția pulmonară periferică nu are efect terapeutic.Eficiența transducției virale este direct legată de timpul de rezidență al purtătorului.Cu toate acestea, fluidele de livrare, cum ar fi purtătorii de gene, difuzează în mod natural în alveole în timpul inhalării, iar particulele terapeutice de orice formă sunt îndepărtate rapid prin transportul mucociliar.Extinderea timpului de rezidență al purtătorilor de gene în tractul respirator este importantă, dar dificil de realizat.Particulele magnetice conjugate cu purtător care pot fi direcționate către suprafața tractului respirator pot îmbunătăți țintirea regională.Datorită problemelor legate de imagistica in vivo, comportamentul unor astfel de particule magnetice mici pe suprafața căilor respiratorii în prezența unui câmp magnetic aplicat este puțin înțeles.Scopul acestui studiu a fost de a utiliza imagistica cu sincrotron pentru a vizualiza in vivo mișcarea unei serii de particule magnetice în traheea șobolanilor anesteziați pentru a studia dinamica și modelele de comportament ale particulelor simple și în vrac in vivo.Apoi am evaluat, de asemenea, dacă livrarea de particule magnetice lentivirale în prezența unui câmp magnetic ar crește eficiența transducției în traheea șobolanului.Imagistica cu raze X cu sincrotron arată comportamentul particulelor magnetice în câmpuri magnetice staționare și în mișcare in vitro și in vivo.Particulele nu pot fi trase cu ușurință pe suprafața căilor aeriene vii cu ajutorul magneților, dar în timpul transportului, depunerile sunt concentrate în câmpul vizual, unde câmpul magnetic este cel mai puternic.Eficiența transducției a fost, de asemenea, crescută de șase ori atunci când particulele magnetice lentivirale au fost livrate în prezența unui câmp magnetic.Luate împreună, aceste rezultate sugerează că particulele magnetice lentivirale și câmpurile magnetice pot fi abordări valoroase pentru a îmbunătăți țintirea vectorului genic și nivelurile de transducție în căile aeriene conductoare in vivo.
Fibroza chistică (CF) este cauzată de variații ale unei singure gene numită regulator de conductanță transmembranară CF (CFTR).Proteina CFTR este un canal ionic care este prezent în multe celule epiteliale din organism, inclusiv în căile respiratorii, un loc major în patogenia fibrozei chistice.Defectele CFTR duc la transportul anormal de apă, deshidratarea suprafeței căilor respiratorii și scăderea adâncimii stratului de fluid de suprafață a căilor respiratorii (ASL).De asemenea, afectează capacitatea sistemului de transport mucociliar (MCT) de a curăța căile respiratorii de particulele inhalate și agenții patogeni.Scopul nostru este de a dezvolta o terapie genetică lentivirală (LV) pentru a furniza copia corectă a genei CFTR și pentru a îmbunătăți ASL, MCT și sănătatea plămânilor și pentru a continua dezvoltarea de noi tehnologii care pot măsura acești parametri in vivo1.
Vectorii VS sunt unul dintre candidații principali pentru terapia genică a fibrozei chistice, în principal pentru că pot integra permanent gena terapeutică în celulele bazale ale căilor respiratorii (celule stem ale căilor respiratorii).Acest lucru este important deoarece pot restabili hidratarea normală și eliminarea mucusului prin diferențierea în celule funcționale de suprafață a căilor respiratorii corectate de gene asociate cu fibroza chistică, rezultând beneficii pe tot parcursul vieții.Vectorii VS trebuie direcționați împotriva căilor respiratorii conductoare, deoarece aici începe implicarea plămânilor în FC.Livrarea vectorului mai adânc în plămân poate duce la transducția alveolară, dar aceasta nu are efect terapeutic în fibroza chistică.Cu toate acestea, fluidele precum purtătorii de gene migrează în mod natural în alveole atunci când sunt inhalate după naștere3,4 și particulele terapeutice sunt expulzate rapid în cavitatea bucală de către MCT.Eficiența transducției LV este direct legată de perioada de timp în care vectorul rămâne aproape de celulele țintă pentru a permite absorbția celulară - „timpul de rezidență” 5 care este ușor scurtat de fluxul de aer regional tipic, precum și de absorbția coordonată a mucusului și a particulelor MCT.Pentru fibroza chistică, capacitatea de a prelungi timpul de rezidență al VS în căile respiratorii este importantă pentru a obține niveluri ridicate de transducție în această zonă, dar a fost până acum o provocare.
Pentru a depăși acest obstacol, propunem că particulele magnetice LV (MP) pot ajuta în două moduri complementare.În primul rând, ele pot fi ghidate de un magnet către suprafața căilor respiratorii pentru a îmbunătăți țintirea și pentru a ajuta particulele purtătoare de gene să se afle în zona potrivită a căilor respiratorii;și ASL) se deplasează în stratul celular 6. MP-urile sunt utilizate pe scară largă ca vehicule țintite de livrare a medicamentelor atunci când se leagă de anticorpi, medicamente pentru chimioterapie sau alte molecule mici care se atașează de membranele celulare sau se leagă de receptorii de suprafață celulară respectiv și se acumulează la locurile tumorale în prezența electricității statice.Câmpuri magnetice pentru terapia cancerului 7. Alte metode „hipertermice” au ca scop uciderea celulelor tumorale prin încălzirea MP atunci când sunt expuse la câmpuri magnetice oscilante.Principiul transfecției magnetice, în care un câmp magnetic este utilizat ca agent de transfecție pentru a îmbunătăți transferul ADN-ului în celule, este utilizat în mod obișnuit in vitro folosind o serie de vectori genici nevirali și virali pentru linii celulare greu de transdus. ..S-a stabilit eficiența magnetotransfecției LV cu livrarea MP LV in vitro într-o linie celulară de epiteliu bronșic uman în prezența unui câmp magnetic static, crescând eficiența transducției de 186 de ori în comparație cu vectorul LV singur.LV MT a fost de asemenea aplicat la un model in vitro de fibroză chistică, în care transfecția magnetică a crescut transducția LV în culturi de interfață aer-lichid cu un factor de 20 în prezența sputei de fibroză chistică10.Cu toate acestea, magnetotransfecția de organ in vivo a primit relativ puțină atenție și a fost evaluată doar în câteva studii pe animale11,12,13,14,15, în special în plămâni16,17.Cu toate acestea, posibilitățile de transfecție magnetică în terapia pulmonară în fibroza chistică sunt clare.Tan şi colab.(2020) au declarat că „un studiu de validare privind livrarea pulmonară eficientă a nanoparticulelor magnetice va deschide calea pentru viitoare strategii de inhalare CFTR pentru a îmbunătăți rezultatele clinice la pacienții cu fibroză chistică”6.
Comportamentul particulelor magnetice mici de pe suprafața tractului respirator în prezența unui câmp magnetic aplicat este dificil de vizualizat și studiat și, prin urmare, ele sunt puțin înțelese.În alte studii, am dezvoltat o metodă de imagistică cu raze X cu contrast de fază bazată pe propagarea sincrotronului (PB-PCXI) pentru imagistica non-invazivă și cuantificarea modificărilor minuscule in vivo ale adâncimii ASL18 și ale comportamentului MCT19,20 pentru a măsura direct hidratarea suprafeței canalului de gaz. și este utilizat ca un indicator timpuriu al eficacității tratamentului.În plus, metoda noastră de punctare MCT utilizează particule cu diametrul de 10-35 µm compuse din alumină sau sticlă cu indice de refracție ridicat ca markeri MCT vizibili cu PB-PCXI21.Ambele metode sunt potrivite pentru imagistica unei game de tipuri de particule, inclusiv MP.
Datorită rezoluției spațiale și temporale ridicate, testele noastre ASL și MCT bazate pe PB-PCXI sunt potrivite pentru a studia dinamica și modelele comportamentale ale particulelor individuale și în vrac in vivo pentru a ne ajuta să înțelegem și să optimizăm metodele de livrare a genei MP.Abordarea pe care o folosim aici se bazează pe studiile noastre folosind linia de lumină SPring-8 BL20B2, în care am vizualizat mișcarea fluidului după livrarea unei doze de vector inactiv în căile respiratorii nazale și pulmonare ale șoarecilor pentru a ajuta la explicarea tiparelor noastre eterogene de exprimare a genelor observate. în gena noastră.studii pe animale cu o doză purtător de 3,4 .
Scopul acestui studiu a fost de a utiliza sincrotronul PB-PCXI pentru a vizualiza mișcările in vivo ale unei serii de MP în traheea șobolanilor vii.Aceste studii imagistice PB-PCXI au fost concepute pentru a testa seria MP, puterea câmpului magnetic și locația pentru a determina efectul acestora asupra mișcării MP.Am presupus că un câmp magnetic extern ar ajuta MF furnizat să rămână sau să se deplaseze în zona țintă.Aceste studii ne-au permis, de asemenea, să determinăm configurații de magnet care maximizează cantitatea de particule rămase în trahee după depunere.Într-o a doua serie de studii, ne-am propus să folosim această configurație optimă pentru a demonstra modelul de transducție rezultat din livrarea in vivo a LV-MP-urilor către căile respiratorii de șobolan, presupunând că ar rezulta livrarea LV-MP-urilor în contextul țintirii căilor respiratorii. în eficiența crescută a transducției VS..
Toate studiile pe animale au fost efectuate în conformitate cu protocoalele aprobate de Universitatea din Adelaide (M-2019-060 și M-2020-022) și Comitetul de etică a animalelor cu sincrotron SPring-8.Experimentele au fost efectuate în conformitate cu recomandările ARRIVE.
Toate imaginile cu raze X au fost realizate la linia de lumină BL20XU la sincrotronul SPring-8 din Japonia, folosind o configurație similară cu cea descrisă anterior21,22.Pe scurt, cutia experimentală a fost situată la 245 m de inelul de stocare sincrotron.O distanță de la probă la detector de 0,6 m este utilizată pentru studiile de imagistică cu particule și 0,3 m pentru studiile de imagistică in vivo pentru a crea efecte de contrast de fază.S-a folosit un fascicul monocromatic cu o energie de 25 keV.Imaginile au fost achiziționate folosind un traductor de raze X de înaltă rezoluție (SPring-8 BM3) cuplat la un detector sCMOS.Traductorul convertește razele X în lumină vizibilă folosind un scintilator gros de 10 µm (Gd3Al2Ga3O12), care este apoi direcționat către senzorul sCMOS folosind un obiectiv de microscop ×10 (NA 0,3).Detectorul sCMOS a fost un Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japonia) cu o dimensiune a matricei de 2048 × 2048 pixeli și o dimensiune brută a pixelilor de 6,5 × 6,5 µm.Această setare oferă o dimensiune efectivă a pixelului izotrop de 0,51 µm și un câmp vizual de aproximativ 1,1 mm × 1,1 mm.Durata de expunere de 100 ms a fost aleasă pentru a maximiza raportul semnal-zgomot al particulelor magnetice din interiorul și din exteriorul căilor respiratorii, reducând în același timp artefactele de mișcare cauzate de respirație.Pentru studiile in vivo, un obturator rapid de raze X a fost plasat pe calea razelor X pentru a limita doza de radiație prin blocarea fasciculului de raze X între expuneri.
Mediul LV nu a fost utilizat în niciun studiu de imagistică SPring-8 PB-PCXI, deoarece camera de imagistică BL20XU nu este certificată de Nivelul 2 de Biosecuritate.În schimb, am selectat o gamă de MP bine caracterizați de la doi furnizori comerciali care acoperă o gamă de dimensiuni, materiale, concentrații de fier și aplicații , — mai întâi pentru a înțelege modul în care câmpurile magnetice afectează mișcarea MP în capilarele de sticlă și apoi în căile respiratorii vii.suprafaţă.Dimensiunea MP variază de la 0,25 la 18 µm și este realizată din diferite materiale (a se vedea tabelul 1), dar compoziția fiecărei probe, inclusiv dimensiunea particulelor magnetice din MP, este necunoscută.Pe baza studiilor noastre extinse MCT 19, 20, 21, 23, 24, ne așteptăm ca MP până la 5 µm să poată fi văzute pe suprafața căilor respiratorii traheale, de exemplu, prin scăderea cadrelor consecutive pentru a vedea o vizibilitate îmbunătățită a mișcării MP.Un singur MP de 0,25 µm este mai mic decât rezoluția dispozitivului de imagistică, dar este de așteptat ca PB-PCXI să detecteze contrastul lor volumetric și mișcarea lichidului de suprafață pe care sunt depuse după depunere.
Mostre pentru fiecare MP din tabel.1 a fost preparat în capilare de sticlă de 20 μl (Drummond Microcaps, PA, SUA) cu un diametru intern de 0,63 mm.Particulele corpusculare sunt disponibile în apă, în timp ce particulele CombiMag sunt disponibile în lichidul proprietar al producătorului.Fiecare tub este umplut pe jumătate cu lichid (aproximativ 11 µl) și plasat pe suportul pentru probă (vezi Figura 1).Capilarele de sticlă au fost plasate orizontal pe scena în camera de imagistică, respectiv, și poziționate la marginile lichidului.Un magnet cu înveliș de nichel cu diametrul de 19 mm (lungime 28 mm) realizat din pământuri rare, neodim, fier și bor (NdFeB) (N35, nr. cat. LM1652, Jaycar Electronics, Australia) cu o remanență de 1,17 T a fost atașat unui tabel de transfer separat pentru a realiza Schimbați de la distanță poziția în timpul redării.Imagistica cu raze X începe atunci când magnetul este poziționat la aproximativ 30 mm deasupra eșantionului și imaginile sunt achiziționate la 4 cadre pe secundă.În timpul imaginii, magnetul a fost adus aproape de tubul capilar de sticlă (la o distanță de aproximativ 1 mm) și apoi mutat de-a lungul tubului pentru a evalua efectul intensității câmpului și al poziției.
O configurație de imagistică in vitro care conține mostre de MP în capilare de sticlă în stadiul de translație a probei xy.Calea fasciculului de raze X este marcată cu o linie punctată roșie.
Odată stabilită vizibilitatea in vitro a MP, un subset dintre aceștia a fost testat in vivo pe femele de șobolan albino Wistar de tip sălbatic (~ 12 săptămâni, ~ 200 g).Medetomidină 0,24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Japonia), midazolam 3,2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Japonia) și butorfanol 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Șobolanii au fost anesteziați cu amestec Pharma (Japonia) prin injecție intraperitoneală.După anestezie, au fost pregătiți pentru imagistică prin îndepărtarea blanii din jurul traheei, introducerea unui tub endotraheal (ET; canulă intravenoasă de 16 Ga, Terumo BCT) și imobilizarea lor în decubit dorsal pe o placă imagistică personalizată care conține o pungă termică. pentru a menține temperatura corpului.22. Placa de imagistică a fost apoi atașată la etapa de probă în cutia de imagistică la un unghi ușor pentru a alinia traheea orizontal pe imaginea cu raze X, așa cum se arată în Figura 2a.
(a) Configurare imagistică in vivo în unitatea de imagistică SPring-8, calea fasciculului de raze X marcată cu linie punctată roșie.(b, c) Localizarea magnetului traheal a fost efectuată de la distanță folosind două camere IP montate ortogonal.În partea stângă a imaginii de pe ecran, puteți vedea bucla de sârmă care ține capul și canula de livrare instalată în interiorul tubului ET.
Un sistem de pompă cu seringă controlat de la distanță (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) care folosește o seringă de sticlă de 100 pl a fost conectat la un tub PE10 (0,61 mm OD, 0,28 mm ID) folosind un ac de 30 Ga.Marcați tubul pentru a vă asigura că vârful este în poziția corectă în trahee atunci când introduceți tubul endotraheal.Folosind o micropompă, pistonul seringii a fost îndepărtat și vârful tubului a fost scufundat în proba MP care urmează să fie livrată.Tubul de livrare încărcat a fost apoi introdus în tubul endotraheal, plasând vârful în partea cea mai puternică a câmpului magnetic aplicat.Achiziția imaginilor a fost controlată folosind un detector de respirație conectat la cutia noastră de sincronizare bazată pe Arduino și toate semnalele (de exemplu, temperatură, respirație, deschidere/închidere obturator și achiziție de imagini) au fost înregistrate folosind Powerlab și LabChart (AD Instruments, Sydney, Australia) 22 Când carcasa nu era disponibilă, două camere IP (Panasonic BB-SC382) au fost poziționate la aproximativ 90 ° una față de cealaltă și utilizate pentru a controla poziția magnetului în raport cu traheea în timpul imaginii (Figura 2b, c).Pentru a minimiza artefactele de mișcare, a fost obținută o imagine pe respirație în timpul platoului fluxului respirator terminal.
Magnetul este atașat la a doua etapă, care poate fi amplasată de la distanță în exteriorul corpului de imagine.Au fost testate diferite poziții și configurații ale magnetului, inclusiv: plasat la un unghi de aproximativ 30° deasupra traheei (configurațiile sunt prezentate în figurile 2a și 3a);un magnet deasupra animalului și celălalt dedesubt, cu polii stabiliți pentru atracție (Figura 3b)., un magnet deasupra animalului și unul dedesubt, cu polii stabiliți pentru repulsie (Figura 3c) și un magnet deasupra și perpendicular pe trahee (Figura 3d).După instalarea animalului și a magnetului și încărcarea MP supusă testului în pompa cu seringă, eliberați o doză de 50 µl la o rată de 4 µl/sec la achiziționarea imaginilor.Magnetul este apoi mutat înainte și înapoi de-a lungul sau de-a lungul traheei în timp ce continuă să achiziționeze imagini.
Configurație de magnet pentru imagistica in vivo (a) un magnet deasupra traheei la un unghi de aproximativ 30°, (b) doi magneți configurați pentru atracție, (c) doi magneți configurați pentru repulsie, (d) un magnet deasupra și perpendicular pe trahee.Observatorul a privit în jos de la gură la plămâni prin trahee și fasciculul de raze X a trecut prin partea stângă a șobolanului și a ieșit pe partea dreaptă.Magnetul este fie mutat de-a lungul căilor respiratorii, fie la stânga și la dreapta deasupra traheei în direcția fasciculului de raze X.
De asemenea, am căutat să determinăm vizibilitatea și comportamentul particulelor în căile respiratorii în absența amestecului dintre respirație și ritmul cardiac.Prin urmare, la sfârșitul perioadei de imagistică, animalele au fost eutanasiate în mod uman din cauza supradozajului cu pentobarbital (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, SUA; ~65 mg/kg ip).Unele animale au fost lăsate pe platforma de imagistică, iar după încetarea respirației și a bătăilor inimii, procesul de imagistică a fost repetat, adăugând o doză suplimentară de MP dacă nu era vizibil niciun MP pe suprafața căilor respiratorii.
Imaginile rezultate au fost corectate pentru câmpul plat și întunecat și apoi asamblate într-un film (20 de cadre pe secundă; 15–25 × viteza normală în funcție de rata de respirație) folosind un script personalizat scris în MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Toate studiile privind livrarea vectorului genei LV au fost efectuate la Centrul de Cercetare a Animalelor de Laborator de la Universitatea din Adelaide și au vizat utilizarea rezultatelor experimentului SPring-8 pentru a evalua dacă livrarea LV-MP în prezența unui câmp magnetic ar putea îmbunătăți transferul de gene in vivo. .Pentru a evalua efectele MF și câmpul magnetic, au fost tratate două grupuri de animale: unui grup a fost injectat cu LV MF cu plasare de magnet, iar celălalt grup a fost injectat cu un grup de control cu ​​LV MF fără magnet.
Vectorii genei LV au fost generaţi utilizând metodele descrise anterior 25, 26.Vectorul LacZ exprimă o genă beta-galactozidază localizată nuclear, condusă de promotorul constitutiv MPSV (LV-LacZ), care produce un produs de reacție albastru în celulele transduse, vizibil pe fronturile și secțiunile de țesut pulmonar.Titrarea a fost efectuată în culturi de celule prin numărarea manuală a numărului de celule pozitive pentru LacZ utilizând un hemocitometru pentru a calcula titrul în TU/ml.Purtătorii sunt crioconservați la -80°C, decongelați înainte de utilizare și legați la CombiMag prin amestecarea 1:1 și incubarea pe gheață timp de cel puțin 30 de minute înainte de livrare.
Șobolani Sprague Dawley normali (n = 3/grup, ~2-3 anesteziați ip cu un amestec de 0,4 mg/kg medetomidină (Domitor, Ilium, Australia) și 60 mg/kg ketamina (Ilium, Australia) la vârsta de 1 lună) ip ) injectare și canulare orală nechirurgicală cu o canulă intravenoasă de 16 Ga.Pentru a se asigura că țesutul căilor respiratorii traheale primește transducție VS, a fost condiționat utilizând protocolul nostru de perturbare mecanică descris anterior, în care suprafața căilor respiratorii traheale a fost frecată axial cu un coș de sârmă (N-Circle, extractor de piatră de nitinol fără vârf NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, SUA) 30 p28.Apoi, la aproximativ 10 minute după perturbarea din cabinetul de biosecuritate, a fost efectuată administrarea traheală a LV-MP.
Câmpul magnetic utilizat în acest experiment a fost configurat în mod similar cu un studiu cu raze X in vivo, cu aceiași magneți ținuți peste trahee cu cleme de stent de distilare (Figura 4).Un volum de 50 ui (2 x 25 ui alicote) de LV-MP a fost livrat în trahee (n = 3 animale) folosind o pipetă cu vârf de gel, așa cum a fost descris anterior.Grupul de control (n = 3 animale) a primit același LV-MP fără utilizarea unui magnet.După terminarea perfuziei, canula este îndepărtată din tubul endotraheal și animalul este extubat.Magnetul rămâne pe loc timp de 10 minute înainte de a fi îndepărtat.Șobolanii au fost administrați subcutanat cu meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Australia), urmat de retragerea anesteziei prin injectare intraperitoneală a 1 mg/kg clorhidrat de atipamazol (Antisedan, Zoetis, Australia).Șobolanii au fost ținuți la cald și observați până la recuperarea completă din anestezie.
Dispozitiv de livrare LV-MP într-un cabinet de siguranță biologică.Puteți vedea că manșonul Luer-lock gri deschis al tubului ET iese din gură, iar vârful pipetei cu gel prezentat în figură este introdus prin tubul ET până la adâncimea dorită în trahee.
La o săptămână după procedura de administrare LV-MP, animalele au fost sacrificate în mod uman prin inhalarea a 100% CO2 și expresia LacZ a fost evaluată folosind tratamentul nostru standard X-gal.Cele trei inele cartilajului cele mai caudale au fost îndepărtate pentru a se asigura că orice deteriorare mecanică sau retenție de lichid din cauza plasării tubului endotraheal nu va fi inclusă în analiză.Fiecare trahee a fost tăiată pe lungime pentru a obține două jumătăți pentru analiză și a fost plasată într-o cană care conține cauciuc siliconic (Sylgard, Dow Inc) folosind un ac Minutien (Fine Science Tools) pentru a vizualiza suprafața luminală.Distribuția și caracterul celulelor transduse au fost confirmate prin fotografiere frontală folosind un microscop Nikon (SMZ1500) cu o cameră DigiLite și software-ul TCapture (Tucsen Photonics, China).Imaginile au fost achiziționate la o mărire de 20x (inclusiv setarea maximă pentru lățimea completă a traheei), cu întreaga lungime a traheei afișată pas cu pas, oferind suficientă suprapunere între fiecare imagine pentru a permite imaginilor să fie „cusăte”.Imaginile din fiecare trahee au fost apoi combinate într-o singură imagine compozită folosind Composite Image Editor versiunea 2.0.3 (Microsoft Research) utilizând algoritmul de mișcare plană. Zona de expresie a LacZ din imaginile compozite traheale de la fiecare animal a fost cuantificată folosind un script MATLAB automat (R2020a, MathWorks) așa cum a fost descris anterior28, folosind setări de 0,35 < Hue < 0,58, Saturation > 0,15 și Value < 0,7. Zona de expresie a LacZ din imaginile compozite traheale de la fiecare animal a fost cuantificată folosind un script MATLAB automat (R2020a, MathWorks) așa cum a fost descris anterior28, folosind setări de 0,35 < Hue < 0,58, Saturation > 0,15 și Value < 0,7. Площадь экспрессии LacZ в составных изображениях трахеи от каждого животного была количественно определена с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0 ,7. Zona de expresie a LacZ în imaginile traheale compozite de la fiecare animal a fost cuantificată folosind un script MATLAB automat (R2020a, MathWorks) așa cum s-a descris anterior28 folosind setări de 0,350,15 și valoarea <0,7.如前所述，使用自动MATLAB 脚本（R2020a，MathWorks）对来自每只动物的气管复合图像中的LacZ 表达区域进行量化，使用0.35 < 色调< 0.58、饱和度> 0.15 和值< 0.7 的设置。如 前所 述 ， 自动 自动 Matlab 脚本 （（r2020a ， Mathworks） 来自 每 只 的 气管 复合 图像 的 的 的 的 表达 量化 ， 使用 使用 使用 0.35 <色调 <0.58 、> 0.15 和值 <0.7 的。。。。。 。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 HIP Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно определяли с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0,7 . Zonele de expresie LacZ pe imaginile compozite ale traheei fiecărui animal au fost cuantificate folosind un script MATLAB automat (R2020a, MathWorks) așa cum a fost descris anterior folosind setări de 0,35 < nuanță < 0,58, saturație > 0,15 și valoare < 0,7.Prin urmărirea contururilor țesuturilor în GIMP v2.10.24, a fost creată manual o mască pentru fiecare imagine compozită pentru a identifica zona țesutului și a preveni orice detecții false în afara țesutului traheal.Zonele colorate din toate imaginile compozite de la fiecare animal au fost însumate pentru a da suprafața totală colorată pentru acel animal.Zona vopsită a fost apoi împărțită la suprafața totală a măștii pentru a obține o zonă normalizată.
Fiecare trahee a fost înglobată în parafină și secționată cu o grosime de 5 um.Secțiunile au fost contracolorate cu roșu neutru rapid timp de 5 minute și imaginile au fost achiziționate folosind un microscop Nikon Eclipse E400, o cameră DS-Fi3 și un software de captare a elementelor NIS (versiunea 5.20.00).
Toate analizele statistice au fost efectuate în GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).Semnificația statistică a fost stabilită la p ≤ 0,05.Normalitatea a fost testată folosind testul Shapiro-Wilk și diferențele în colorarea LacZ au fost evaluate folosind un test t nepereche.
Cele șase MP descrise în Tabelul 1 au fost examinate de PCXI, iar vizibilitatea este descrisă în Tabelul 2. Două MP de polistiren (MP1 și MP2; 18 µm și, respectiv, 0,25 µm) nu au fost vizibile de PCXI, dar mostrele rămase au putut fi identificate (exemplele sunt prezentate în Figura 5).MP3 și MP4 sunt slab vizibile (10-15% Fe3O4; 0,25 µm și, respectiv, 0,9 µm).Deși MP5 (98% Fe3O4; 0,25 µm) conținea unele dintre cele mai mici particule testate, a fost cea mai pronunțată.Produsul CombiMag MP6 este greu de distins.În toate cazurile, capacitatea noastră de a detecta MF a fost mult îmbunătățită prin mișcarea magnetului înainte și înapoi paralel cu capilarul.Pe măsură ce magneții s-au îndepărtat de capilar, particulele au fost scoase în lanțuri lungi, dar pe măsură ce magneții s-au apropiat și puterea câmpului magnetic a crescut, lanțurile de particule s-au scurtat pe măsură ce particulele au migrat spre suprafața superioară a capilarului (vezi videoclipul suplimentar S1 : MP4), crescând densitatea particulelor la suprafață.În schimb, atunci când magnetul este îndepărtat din capilar, puterea câmpului scade și MP-urile se rearanjează în lanțuri lungi care se extind de la suprafața superioară a capilarului (vezi videoclipul suplimentar S2: MP4).După ce magnetul încetează să se miște, particulele continuă să se miște un timp după ce au ajuns în poziția de echilibru.Pe măsură ce MP se deplasează spre și departe de suprafața superioară a capilarului, particulele magnetice au tendința de a atrage resturile prin lichid.
Vizibilitatea MP sub PCXI variază considerabil între probe.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 și (d) MP6.Toate imaginile prezentate aici au fost realizate cu un magnet poziționat la aproximativ 10 mm direct deasupra capilarului.Cercurile aparent mari sunt bule de aer prinse în capilare, arătând clar caracteristicile marginilor alb-negru ale imaginii cu contrast de fază.Caseta roșie indică mărirea care sporește contrastul.Rețineți că diametrele circuitelor magnetului din toate figurile nu sunt la scară și sunt de aproximativ 100 de ori mai mari decât cele prezentate.
Pe măsură ce magnetul se mișcă la stânga și la dreapta de-a lungul vârfului capilarului, unghiul șirului MP se schimbă pentru a se alinia cu magnetul (vezi Figura 6), delimitând astfel liniile câmpului magnetic.Pentru MP3-5, după ce coarda atinge unghiul de prag, particulele trage de-a lungul suprafeței superioare a capilarului.Acest lucru duce adesea la gruparea MP-urilor în grupuri mai mari, în apropierea locului unde câmpul magnetic este cel mai puternic (vezi videoclipul suplimentar S3: MP5).Acest lucru este, de asemenea, evident mai ales atunci când se realizează imagini în apropierea capătului capilarului, ceea ce determină agregarea și concentrarea MP la interfața lichid-aer.Particulele din MP6, care au fost mai greu de distins decât cele din MP3-5, nu s-au deplasat atunci când magnetul s-a deplasat de-a lungul capilarului, dar șirurile MP s-au disociat, lăsând particulele la vedere (vezi videoclipul suplimentar S4: MP6).În unele cazuri, când câmpul magnetic aplicat a fost redus prin mișcarea magnetului la o distanță mare de locul de imagistică, orice MP rămași a coborât încet pe suprafața inferioară a tubului prin gravitație, rămânând în șir (vezi videoclipul suplimentar S5: MP3) .
Unghiul șirului MP se schimbă pe măsură ce magnetul se deplasează spre dreapta deasupra capilarului.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 și (d) MP6.Caseta roșie indică mărirea care sporește contrastul.Vă rugăm să rețineți că videoclipurile suplimentare au scop informativ, deoarece dezvăluie o structură importantă a particulelor și informații dinamice care nu pot fi vizualizate în aceste imagini statice.
Testele noastre au arătat că mișcarea lent a magnetului înainte și înapoi de-a lungul traheei facilitează vizualizarea MF în contextul mișcării complexe in vivo.Nu s-au efectuat teste in vivo deoarece granulele de polistiren (MP1 și MP2) nu au fost vizibile în capilar.Fiecare dintre cele patru MF rămase a fost testat in vivo cu axa lungă a magnetului poziționată peste trahee la un unghi de aproximativ 30° față de verticală (a se vedea figurile 2b și 3a), deoarece acest lucru a dus la lanțuri MF mai lungi și a fost mai eficient. decât un magnet..configurația s-a încheiat.MP3, MP4 și MP6 nu au fost găsite în traheea niciunui animal vii.La vizualizarea tractului respirator al șobolanilor după uciderea umană a animalelor, particulele au rămas invizibile chiar și atunci când a fost adăugat volum suplimentar folosind o pompă cu seringă.MP5 a avut cel mai mare conținut de oxid de fier și a fost singura particulă vizibilă, așa că a fost folosit pentru a evalua și caracteriza comportamentul MP ​​in vivo.
Plasarea magnetului peste trahee în timpul introducerii MF a dus la concentrarea multor MF, dar nu a tuturor, în câmpul vizual.Intrarea traheală a particulelor se observă cel mai bine la animalele eutanasiate în mod uman.Figura 7 și videoclipul suplimentar S6: MP5 arată capturarea magnetică rapidă și alinierea particulelor de pe suprafața traheei ventrale, indicând faptul că MP-urile pot fi direcționate către zonele dorite ale traheei.Când se caută mai distal de-a lungul traheei după livrarea MF, unele MF au fost găsite mai aproape de carină, ceea ce indică o putere insuficientă a câmpului magnetic pentru a colecta și reține toate MF, deoarece acestea au fost livrate prin regiunea de intensitate maximă a câmpului magnetic în timpul administrării fluidului.proces.Cu toate acestea, concentrațiile de MP postnatale au fost mai mari în jurul zonei imaginii, ceea ce sugerează că mulți MP au rămas în regiunile căilor respiratorii unde puterea câmpului magnetic aplicat a fost cea mai mare.
Imagini cu (a) înainte și (b) după livrarea MP5 în traheea unui șobolan eutanasiat recent cu un magnet plasat chiar deasupra zonei de imagistică.Zona reprezentată este situată între două inele cartilaginoase.Există ceva lichid în căile respiratorii înainte ca MP să fie livrat.Caseta roșie indică mărirea care sporește contrastul.Aceste imagini sunt preluate din videoclipul prezentat în S6: Video suplimentar MP5.
Mișcarea magnetului de-a lungul traheei in vivo a dus la o schimbare a unghiului lanțului MP pe suprafața căilor respiratorii, similară cu cea observată în capilare (vezi Figura 8 și videoclipul suplimentar S7: MP5).Cu toate acestea, în studiul nostru, MP nu au putut fi târâți de-a lungul suprafeței căilor respiratorii vii, așa cum ar putea face capilarele.În unele cazuri, lanțul MP ​​se prelungește pe măsură ce magnetul se mișcă la stânga și la dreapta.Interesant, am constatat, de asemenea, că lanțul de particule modifică adâncimea stratului de suprafață al fluidului atunci când magnetul este deplasat longitudinal de-a lungul traheei și se extinde atunci când magnetul este mutat direct deasupra capului și lanțul de particule este rotit într-o poziție verticală (vezi Video suplimentar S7).: MP5 la 0:09, dreapta jos).Modelul caracteristic de mișcare s-a schimbat atunci când magnetul a fost deplasat lateral peste partea superioară a traheei (adică la stânga sau la dreapta animalului, mai degrabă decât pe lungimea traheei).Particulele erau încă clar vizibile în timpul mișcării lor, dar când magnetul a fost îndepărtat din trahee, vârfurile șirurilor de particule au devenit vizibile (vezi videoclipul suplimentar S8: MP5, începând cu ora 0:08).Acest lucru este de acord cu comportamentul observat al câmpului magnetic sub acțiunea unui câmp magnetic aplicat într-un capilar de sticlă.
Exemple de imagini care arată MP5 în traheea unui șobolan viu anesteziat.(a) Magnetul este folosit pentru a obține imagini deasupra și în stânga traheei, apoi (b) după mutarea magnetului la dreapta.Caseta roșie indică mărirea care sporește contrastul.Aceste imagini sunt din videoclipul prezentat în videoclipul suplimentar al lui S7: MP5.
Când cei doi poli au fost reglați într-o orientare nord-sud deasupra și dedesubtul traheei (adică, atrăgând; Fig. 3b), coardele MP au apărut mai lungi și au fost situate pe peretele lateral al traheei mai degrabă decât pe suprafața dorsală a traheei. trahee (vezi Anexa).Video S9:MP5).Cu toate acestea, concentrații mari de particule la un loc (adică, suprafața dorsală a traheei) nu au fost detectate după administrarea fluidului folosind un dispozitiv cu magnet dublu, care apare de obicei cu un dispozitiv cu un singur magnet.Apoi, când un magnet a fost configurat să respingă polii opuși (Figura 3c), numărul de particule vizibile în câmpul vizual nu a crescut după livrare.Configurarea celor două configurații de magneti este o provocare din cauza puterii mari a câmpului magnetic care atrage sau, respectiv, împinge magneții.Configurația a fost apoi schimbată la un singur magnet paralel cu căile respiratorii, dar care trecea prin căile respiratorii la un unghi de 90 de grade, astfel încât liniile de forță traversează peretele traheal ortogonal (Figura 3d), o orientare menită să determine posibilitatea de agregare a particulelor pe peretele lateral.fi observat.Cu toate acestea, în această configurație, nu a existat o mișcare identificabilă de acumulare MF sau o mișcare a magnetului.Pe baza tuturor acestor rezultate, a fost aleasă o configurație cu un singur magnet și o orientare de 30 de grade pentru studiile in vivo ale purtătorilor de gene (Fig. 3a).
Când animalul a fost fotografiat de mai multe ori imediat după ce a fost sacrificat în mod uman, absența mișcării țesuturilor interferente a însemnat că liniile de particule mai fine și mai scurte puteau fi deslușite în câmpul intercartilaginos clar, „legănându-se” în conformitate cu mișcarea de translație a magnetului.vedeți clar prezența și mișcarea particulelor MP6.
Titrul de LV-LacZ a fost de 1,8 x 108 UI/ml, iar după amestecarea 1:1 cu CombiMag MP (MP6), animalele au fost injectate cu 50 µl dintr-o doză traheală de 9 x 107 UI/ml de vehicul LV (adică 4,5 x 106 TU/șobolan).).).În aceste studii, în loc să mișcăm magnetul în timpul travaliului, am fixat magnetul într-o singură poziție pentru a determina dacă transducția VS ar putea (a) fi îmbunătățită în comparație cu livrarea vectorului în absența unui câmp magnetic și (b) dacă căile respiratorii ar putea fii atent.Celulele fiind transduse în zonele țintă magnetice ale tractului respirator superior.
Prezența magneților și utilizarea CombiMag în combinație cu vectori LV nu par să afecteze negativ sănătatea animală, la fel ca protocolul nostru standard de livrare a vectorului LV.Imaginile frontale ale regiunii traheale supuse perturbațiilor mecanice (Figura 1 suplimentară) au arătat că grupul tratat cu LV-MP a avut niveluri semnificativ mai mari de transducție în prezența unui magnet (Fig. 9a).Doar o cantitate mică de colorare albastră LacZ a fost prezentă în grupul de control (Figura 9b).Cuantificarea regiunilor normalizate colorate cu X-Gal a arătat că administrarea de LV-MP în prezența unui câmp magnetic a dus la o îmbunătățire de aproximativ 6 ori (Fig. 9c).
Exemplu de imagini compozite care arată transducția traheală cu LV-MP (a) în prezența unui câmp magnetic și (b) în absența unui magnet.(c) Îmbunătățire semnificativă statistic a zonei normalizate a transducției LacZ în trahee cu utilizarea unui magnet (*p = 0,029, test t, n = 3 per grup, medie ± eroare standard a mediei).
Secțiunile neutre rapide colorate cu roșu (exemplul prezentat în Fig. 2 suplimentară) au indicat că celulele colorate cu LacZ au fost prezente în aceeași probă și în aceeași locație ca cea raportată anterior.
Provocarea cheie în terapia genică a căilor respiratorii rămâne localizarea precisă a particulelor purtătoare în zonele de interes și atingerea unui nivel ridicat de eficiență de transducție în plămânul mobil în prezența fluxului de aer și a clearance-ului mucusului activ.Pentru purtătorii VS destinati tratamentului bolilor respiratorii în fibroza chistică, creșterea timpului de rezidență al particulelor purtătoare în căile aeriene conductoare a fost până acum un obiectiv de neatins.După cum au subliniat de către Castellani și colab., utilizarea câmpurilor magnetice pentru a îmbunătăți transducția are avantaje față de alte metode de livrare a genelor, cum ar fi electroporația, deoarece poate combina simplitatea, economia, livrarea localizată, eficiența crescută și timpul de incubare mai scurt.și posibil o doză mai mică de vehicul10.Cu toate acestea, depunerea și comportamentul in vivo a particulelor magnetice în căile respiratorii sub influența forțelor magnetice externe nu au fost niciodată descrise și, de fapt, capacitatea acestei metode de a crește nivelurile de expresie a genelor în căile respiratorii vii intacte nu a fost demonstrată in vivo.
Experimentele noastre in vitro pe sincrotronul PCXI au arătat că toate particulele pe care le-am testat, cu excepția polistirenului MP, au fost vizibile în configurația de imagini pe care am folosit-o.În prezența unui câmp magnetic, câmpurile magnetice formează șiruri, a căror lungime este legată de tipul de particule și de puterea câmpului magnetic (adică, proximitatea și mișcarea magnetului).După cum se arată în Figura 10, șirurile pe care le observăm sunt formate pe măsură ce fiecare particulă individuală devine magnetizată și induce propriul câmp magnetic local.Aceste câmpuri separate fac ca alte particule similare să se colecteze și să se conecteze cu mișcările șirurilor de grup datorită forțelor locale de la forțele locale de atracție și repulsie a altor particule.
Diagrama care arată (a, b) lanțuri de particule care se formează în interiorul capilarelor umplute cu lichid și (c, d) o trahee umplută cu aer.Rețineți că capilarele și traheea nu sunt desenate la scară.Panoul (a) conține, de asemenea, o descriere a particulelor de MF care conține Fe3O4 dispuse în lanțuri.
Când magnetul s-a deplasat peste capilar, unghiul șirului de particule a atins pragul critic pentru MP3-5 care conține Fe3O4, după care șirul de particule nu a mai rămas în poziția inițială, ci s-a deplasat de-a lungul suprafeței într-o nouă poziție.magnet.Acest efect apare probabil deoarece suprafața capilarului de sticlă este suficient de netedă pentru a permite această mișcare.Interesant este că MP6 (CombiMag) nu s-a comportat în acest fel, poate pentru că particulele erau mai mici, aveau o acoperire diferită sau o încărcătură de suprafață diferită, sau fluidul purtător proprietar le-a afectat capacitatea de mișcare.Contrastul din imaginea particulelor CombiMag este, de asemenea, mai slab, sugerând că lichidul și particulele pot avea aceeași densitate și, prin urmare, nu se pot deplasa cu ușurință unul spre celălalt.Particulele se pot bloca, de asemenea, dacă magnetul se mișcă prea repede, ceea ce indică faptul că puterea câmpului magnetic nu poate depăși întotdeauna frecarea dintre particulele din fluid, sugerând că puterea câmpului magnetic și distanța dintre magnet și zona țintă nu ar trebui să fie un surprinde.important.Aceste rezultate indică, de asemenea, că, deși magneții pot captura multe microparticule care curg prin zona țintă, este puțin probabil ca magneții să se poată baza pentru a muta particulele CombiMag de-a lungul suprafeței traheei.Astfel, am ajuns la concluzia că studiile in vivo LV MF ar trebui să utilizeze câmpuri magnetice statice pentru a viza fizic zone specifice ale arborelui căilor respiratorii.
Odată ce particulele sunt introduse în corp, ele sunt dificil de identificat în contextul țesutului complex în mișcare al corpului, dar capacitatea lor de detectare a fost îmbunătățită prin deplasarea orizontală a magnetului peste trahee pentru a „mișca” șirurile MP.În timp ce imagistica în timp real este posibilă, este mai ușor să discerneți mișcarea particulelor după ce animalul a fost ucis uman.Concentrațiile MP au fost de obicei cele mai mari în această locație atunci când magnetul a fost poziționat peste zona de imagistică, deși unele particule au fost de obicei găsite mai jos în trahee.Spre deosebire de studiile in vitro, particulele nu pot fi târâte în trahee prin mișcarea unui magnet.Această constatare este în concordanță cu modul în care mucusul care acoperă suprafața traheei procesează în mod obișnuit particulele inhalate, prinzându-le în mucus și, ulterior, curățându-le prin mecanismul de curățare muco-ciliar.
Am emis ipoteza că utilizarea magneților deasupra și dedesubtul traheei pentru atracție (Fig. 3b) ar putea duce la un câmp magnetic mai uniform, mai degrabă decât un câmp magnetic foarte concentrat într-un punct, ceea ce poate duce la o distribuție mai uniformă a particulelor..Cu toate acestea, studiul nostru preliminar nu a găsit dovezi clare care să susțină această ipoteză.În mod similar, setarea unei perechi de magneți pentru a respinge (Fig. 3c) nu a dus la depunerea mai multor particule în zona imaginii.Aceste două descoperiri demonstrează că configurația cu dublu magnet nu îmbunătățește în mod semnificativ controlul local al punctării MP și că forțele magnetice puternice rezultate sunt dificil de reglat, făcând această abordare mai puțin practică.În mod similar, orientarea magnetului deasupra și peste trahee (Figura 3d) nu a crescut, de asemenea, numărul de particule rămase în zona imaginii.Este posibil ca unele dintre aceste configurații alternative să nu aibă succes, deoarece au ca rezultat o reducere a intensității câmpului magnetic în zona de depunere.Astfel, configurația cu un singur magnet la 30 de grade (Fig. 3a) este considerată cea mai simplă și eficientă metodă de testare in vivo.
Studiul LV-MP a arătat că atunci când vectorii LV au fost combinați cu CombiMag și eliberați după ce au fost deranjați fizic în prezența unui câmp magnetic, nivelurile de transducție au crescut semnificativ în trahee în comparație cu martorii.Pe baza studiilor imagistice cu sincrotron și a rezultatelor LacZ, câmpul magnetic părea să fie capabil să mențină LV în trahee și să reducă numărul de particule de vector care au pătruns imediat adânc în plămân.Astfel de îmbunătățiri ale direcționării pot duce la o eficiență mai mare, reducând în același timp titrurile furnizate, transducția nețintă, efectele secundare inflamatorii și imune și costurile de transfer de gene.Important, conform producătorului, CombiMag poate fi utilizat în combinație cu alte metode de transfer de gene, inclusiv alți vectori virali (cum ar fi AAV) și acizi nucleici.