Giardia duodenum este un organism parazit care cauzează giardioza, o infecție intestinală frecvent întâlnită în special la copiii mici cu semne clinice de diaree.Am raportat anterior că G. duodenalis extracelular declanșează activarea nucleotidelor de legare a receptorului 3 asemănător oligomerizării intracelulare (NLRP3) și reglează răspunsurile inflamatorii ale gazdei prin secreția de vezicule extracelulare (EV).Cu toate acestea, modelele moleculare exacte ale EV duodenococic asociat patogenului (GEV) implicate în acest proces și rolul inflamazomului NLRP3 în giardioză rămân de elucidat.
Plasmidele de expresie eucariote recombinante pcDNA3.1(+)-alfa-2 și alfa-7.3 giardine în GEV au fost construite, transfectate în macrofage peritoneale primare de șoarece și detectate prin măsurarea moleculei țintă a inflamației caspaza-1.Nivelul de expresie p20 a fost verificat..G. duodenalis alfa-2 și alfa-7.3 giardine au fost identificate inițial prin măsurarea inflammazomului NLRP3 (NLRP3, pro-interleukin-1 beta [IL-1β], pro-caspaza-1 și caspaza-1 p20), secreția IL.Nivelurile 1β, nivelurile de oligomerizare a proteinei cu puncte apoptotice (ASC) și localizarea imunofluorescentă a NLRP3 și ASC.Rolul inflammazomului NLRP3 în patogenitatea G. duodenalis a fost apoi evaluat folosind șoareci la care activarea NLRP3 a fost blocată (șoareci NLRP3 blocați) și au fost monitorizate modificările patologice ale greutății corporale, încărcarea parazitară duodenală și țesutul duodenal.În plus, am investigat dacă hiardinele alfa-2 și alfa-7.3 induc secreția de IL-1β in vivo prin intermediul inflamazomului NLRP3 și am determinat rolul acestor molecule în patogenitatea G. duodenalis la șoareci.
Giardinele alfa-2 și alfa-7.3 induc activarea inflamazomului NLRP3 in vitro.Acest lucru a condus la activarea p20 caspaze-1, o creștere a nivelurilor de expresie ale proteinelor NLRP3, pro-IL-1β și pro-caspaze-1, o creștere semnificativă a secreției IL-1β, formarea de pete ASA în citoplasmă și inducerea oligomerizării ASA.Inflamația NLRP3 Pierderea penisului exacerbează patogenitatea G. duodenalis la șoareci.Șoarecii tratați cu chisturi prin gavaj de la șoareci blocați cu NLRP3 au prezentat un număr crescut de trofozoiți și leziuni severe ale vilozităților duodenale, caracterizate prin cripte necrotice cu micșorarea și ramificarea.Experimentele in vivo au arătat că giardinele alfa-2 și alfa-7.3 pot induce secreția de IL-1p prin inflamazomul NLRP3, iar imunizarea cu giardine alfa-2 și alfa-7.3 a redus patogenitatea G. duodenalis la șoareci.
Luate împreună, rezultatele acestui studiu sugerează că giardia alfa-2 și alfa-7.3 provoacă reglarea în creștere a inflamației gazdei NLRP3 și reduc infecțiozitatea G. duodenalis la șoareci, care sunt ținte promițătoare pentru prevenirea giardiozei.
Giardia duodenum este un parazit protozoar extracelular care trăiește în intestinul subțire și provoacă 280 de milioane de cazuri de giardioză cu diaree anual, în special în rândul copiilor mici din țările în curs de dezvoltare [1].Oamenii se infectează prin apă potabilă sau alimente contaminate cu chisturi M. duodenum, care apoi intră în stomac și sunt excretate în sucurile gastrice.Trofozoiții Giardia duodenum se atașează de epiteliul duodenal, provocând greață, vărsături, diaree, dureri abdominale și scădere în greutate.Persoanele cu imunodeficiență și fibroză chistică sunt susceptibile la infecție.Infecția poate apărea și prin sex oral și anal [2].Medicamentele precum metronidazolul, tinidazolul și nitazoxanida sunt opțiunile de tratament preferate pentru infecțiile duodenale [3].Cu toate acestea, aceste medicamente pentru chimioterapie provoacă efecte secundare adverse, cum ar fi greață, carcinogeneză și genotoxicitate [4].Prin urmare, trebuie dezvoltate strategii mai eficiente pentru a preveni infecția cu G. duodenalis.
Inflamazomii sunt o clasă de complexe de proteine ​​​​citosolice care fac parte din răspunsul imun înnăscut, ajutând la apărarea împotriva invaziei agenților patogeni și la mediarea răspunsurilor inflamatorii [5].Printre acești inflamazomi, receptorul 3 de oligomerizare cu legare de nucleotide (NOD) (NLRP3) oligomerizare de legare de nucleotide (NLRP3) inflamazom asemănător cu legare de nucleotide a fost studiat pe larg deoarece poate fi detectat prin diferite modele moleculare asociate patogenului/daunelor (PAMP/ DAMP), recunoaște, activează sistemul imunitar înnăscut.și reglează homeostazia intestinală în multe boli inflamatorii [6,7,8].Acesta constă din receptorul de recunoaștere a modelului (PRR) NLRP3, o proteină apoptotică pete adaptoare (ASC) și un efector procaspază-1 sau procaspază-11.Inflamazomul NLRP3 acționează ca o gazdă împotriva invaziei patogenului, așa cum s-a observat în studiile Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10] și Leishmania.[11], dar s-a raportat, de asemenea, că activarea inflamazomului NLRP3 limitează răspunsurile imune protectoare și exacerbează progresia bolii, de exemplu, la viermi [12].Pe baza descoperirilor noastre anterioare, am raportat că G. duodenalis extracelular declanșează activarea intracelulară a inflamației NLRP3 și modulează răspunsurile inflamatorii ale gazdei prin secretarea veziculelor extracelulare (EV) [13].Cu toate acestea, rolul inflamazomului NLRP3 în infecția cu G. duodenalis in vivo rămâne de determinat.
Giardins au fost descriși inițial ca componente structurale ale citoscheletului G. duodenalis și joacă un rol important în motilitatea trofozoitului și atașarea celulelor epiteliale în intestinul subțire.Pentru a se adapta mai bine la mediu și a crește patogenitatea lor, trofozoiții G. duodenalis au dezvoltat o structură citoscheletică unică constând din 8 flageli, 1 corp mijlociu și 1 disc ventral [14].Trofozoiții Giardia duodenului își folosesc citoscheletul pentru a pătrunde în intestinul subțire superior, în special în duoden, și se atașează de enterocite.Ei migrează în mod constant și se atașează de celulele epiteliale folosind metabolismul celular.Prin urmare, există o relație strânsă între citoscheletul lor și virulență.Giardinele specifice pentru Giardia duoden sunt componente ale structurii citoscheletului [15] și sunt împărțite în patru clase: α-, β-, γ- și δ-giardine.Există 21 de membri ai familiei α-giardine, toți având o capacitate dependentă de calciu de a lega fosfolipidele [16].De asemenea, ele conectează citoscheletul la membrana celulară.La indivizii cu diaree cauzată de G. duodenalis, α-giardinele sunt foarte exprimate și imunoreactive în timpul infecției [17].Vaccinurile heterologe bazate pe Giardia alfa-1 sunt protejate împotriva giardiozei la șoareci și sunt potențiali antigeni candidati pentru dezvoltarea vaccinului [18].Alfa-8 giardina, localizată în membrana plasmatică și flageli, dar nu și în discul ventral, sporește motilitatea și rata de creștere a trofozoiților la G. duodenalis [19].Alfa-14 giardin se atașează la structurile microtubulilor de pe flageli și afectează viabilitatea G. duodenalis [20].Giardina alfa-11 este prezentă din abundență pe tot parcursul ciclului de viață, iar supraexprimarea giardinei alfa-11 dăunează G. duodenalis în sine [21].Cu toate acestea, nu este clar dacă alfa-2 giardine și alfa-7.3 giardine sunt de protecție împotriva infecției cu G. duodenalis și a mecanismelor lor subiacente.
În acest studiu, plasmidele recombinate de expresie eucariote pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardine și pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardine au fost transfectate în macrofage peritoneale primare de șoarece pentru a activa gazda NLRP3.Țintele inflamazomilor au fost apoi verificate.De asemenea, am evaluat rolul inflammazomului NLRP3 în patogenitatea G. duodenalis, am investigat dacă alfa-2 și alfa-7,3 giardine induc activarea inflamazomului NLRP3 in vivo și am stabilit că aceste două roluri ale giardinelor în patogenitatea G. duodenalis.Scopul nostru comun a fost de a dezvolta obiective promițătoare pentru prevenirea infecției cu G. duodenalis.
Șoarecii femele C57BL/6 de tip sălbatic (WT) în vârstă de 5-8 săptămâni au fost achiziționați de la Centrul pentru animale experimentale Liaoning Changsheng (Liaoning, China).Șoarecii au avut acces liber la apă, au primit hrană sterilizată și au fost ținuți într-un ciclu lumină/întuneric de 12/12 ore.Înainte de infectare, șoarecii au primit antibiotice ad libitum în apă de băut suplimentată cu ampicilină (1 mg/mL), vancomicină (1 mg/mL) și neomicină (1,4 mg/mL) (toate achiziționate din Shanghai, China, organisme artificiale) [22]. ].].Șoarecii care și-au pierdut capacitatea de a mânca și de a bea timp de > 24 de ore și au pierdut ≥ 20% din greutatea corporală au fost eutanasiați prin dislocare cervicală.
Trofozoiții WB G. duodenalis (American Type Culture Collection, Manassas, SUA) au fost suplimentați cu 12,5% ser fetal bovin (FBS; Every Green, Zhejiang, China) și 0,1% bilă bovină (Sigma-Aldrich, St. Missouri, SUA) ).SUA) în condiții microaerobe.Trofozoiții confluenți au fost colectați pe gheață și trecuți într-un raport de 1:4 pentru reproducere ulterioară.
Chisturile Giardia duodenum au fost induse așa cum s-a descris anterior [23], trofozoiții au fost recoltați în fază logaritmică și apoi diluați cu mediu inducător de încapsulare, pH 7,1 (TYI-S-33 modificat) până la o concentrație finală de 1 × 106 trofozoiți/mL.concentraţie biliară 0,05% mediu).Trofozoiții au fost cultivați în condiții anaerobe la 37°C până la faza de creștere logaritmică.Schimbați mediul în mediu inducător de chisturi (pH 7,8; ​​mediu TYI-S-33 modificat cu 1% concentrație de bilă) și cultivați G. duodenalis la 37°C timp de 48-96 ore, timp în care chisturile de formare au fost observate la microscop.După ce majoritatea trofozoiților au fost induși să formeze chisturi, amestecul de cultură a fost recoltat și resuspendat în apă sterilă deionizată pentru a liza trofozoiții rămași.Chisturile au fost numărate și depozitate la 4°C pentru analize ulterioare printr-un tub gastric la șoareci.
Veziculele extracelulare de Giardia (GEV) au fost îmbogățite așa cum s-a descris anterior [13].Trofozoiții în faza de creștere logaritmică au fost resuspendați în mediu TYI-S-33 modificat preparat cu FBS epuizat în exozomi (Biological Industries, Beit-Haemek, Israel) la o concentrație finală de 1 × 106 paraziți/mL și incubați timp de 12 ore.au fost izolate din supernatantul culturii prin centrifugare la 2000 g timp de 10 min, 10.000 g timp de 45 min și 100.000 g timp de 60 min.Precipitatele au fost dizolvate în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS), cuantificate folosind un kit de analiză a proteinei BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA) și depozitate la -80°C sau utilizate direct pentru analize ulterioare.
Macrofagele peritoneale primare de șoarece au fost preparate așa cum s-a descris anterior [24].Pe scurt, șoarecii (în vârstă de 6-8 săptămâni) au fost injectați (intraperitoneal [ip]) cu 2,5 ml de mediu tioglicol lichid Difco 2,98% (BD, Franklin Lakes, NJ, SUA) și au fost hrăniți 3-4 palate.O suspensie de macrofage a fost colectată din cavitatea abdominală a șoarecilor după eutanasie și centrifugată de 3 ori la 1000 g timp de 10 minute.Celulele recoltate au fost detectate prin citometrie în flux utilizând markerul CD11b până când puritatea celulei a fost > 98%, apoi adăugate la plăci de cultură celulară cu 6 godeuri (4,5 x 106 celule/godeu) și incubate cu 10% FBS (Bioindustry) la 37°C.și 5% CO2.
ARN a fost extras din 1 × 107 trofozoiți în 1 ml de reactiv TRIzol (Vazyme, Nanjing, China), ADN-ul genomic a fost extras din ARN-ul total de G. duodenalis folosind MonScript dsDNase (Monad, Wuhan, China) și ADN-ul complementar (cDNA) a fost sintetizat folosind MonScript RTIIII Super Mix (Monad) conform instrucțiunilor producătorului.
Informațiile despre secvența CDS pentru gena țintă G. duodenalis au fost obținute de la NCBI GenBank.Utilizați Primer 5.0 pentru a proiecta primeri specifici de clonare fără sudură pentru fiecare genă țintă.Primerul direct (5′-3′) constă din trei părți: o secvență suprapusă cu un vector liniarizat pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) și codoni de pornire ATG și GNN (dacă prima bază nu este G).Acest lucru se face pentru a îmbunătăți eficiența expresiei.În plus, cel puțin 16 bp baze combinate (conținut de GC 40–60%/Tm aproximativ 55 °C).Primerul invers (5′-3′) constă din două părți, o secvență suprapusă cu un vector liniarizat EcoRV pcDNA3.1(+) (GCCGCCACTGTGCTGGAT) și o bază combinată de cel puțin 16 bp.(excluzând ultimele două opriri).baze) un codon cum ar fi AA sau GA pentru a permite plasmidelor recombinante să-și exprime proteinele marcate).Secvențele de primer sunt enumerate în Tabelul 1 și au fost sintetizate de Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Changchun, China).
Țintele au fost amplificate utilizând ADN polimeraza Pfu (Tiangen, Beijing, China) sau Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Beijing, China) folosind ca șablon ADNc preparat de G. duodenalis.Plasmida vectorului de expresie eucariotic pcDNA3.1(+) a fost linearizat cu enzima de restricție EcoRV și defosforilat folosind Fast AP (Thermo Fisher Scientific).Fragmentele pcDNA3.1(+) linearizate și fragmentele genei țintă amplificate au fost purificate folosind un kit de purificare cu gel ADN (Tiangen) și cuantificate folosind un Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific).Fragmentul pcDNA3.1(+) și fiecare fragment de genă țintă au fost recombinate utilizând amestecul de clonare cu un singur ansamblu MonClone (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, China) și confirmate prin secvențierea ADN folosind Comate Bioscience Company Limited (Changchun, China)..
Plasmidele fără endotoxine pcDNA3.1(+)-alfa-2 și pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 au fost generate utilizând kitul SanPrep Plasmid Free Endotoxin (Sangon Biotech).Concentrația a fost menținută peste 500 ng/pl pentru a se asigura că EDTA din tamponul de eluție nu a interferat cu testul de transfecție.Macrofagele peritoneale primare de șoarece au fost cultivate în plăci cu 6 godeuri cu mediu RPMI 1640 complet (Biological Industries) timp de 12 ore, apoi celulele au fost spălate de 3 ori în PBS cald pentru a îndepărta penicilina și streptomicina și apoi în mediu suplimentat cu mediu complet.Plasmidele fără endotoxine pcDNA3.1(+)-alfa-2 și pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 (2,5 μg) au fost diluate în 125 μl de mediu seric redus Opti-MEM (Gibco, Thermo Fisher Scientific)..Apoi 5 ui de reactiv de transfecție Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) au fost diluați în 125 ui de mediu Opti-MEM cu ser scăzut.Se prepară complexe lipozom-ADN amestecând plasmida diluată fără endotoxină cu Lipofectamine 2000 și lăsând amestecul să stea la temperatura camerei timp de 5 minute.Transferați complexele separat în celulele din fiecare godeu și amestecați încet.După 4 ore, mediul de cultură celulară a fost înlocuit cu 2 ml de mediu complet RPMI 1640 şi cultura a fost continuată timp de 24 de ore.Mediul proaspăt de cultură celulară a fost adăugat la celule și incubat pentru diferite momente de timp, în funcție de designul testului.
Probele de proteine ​​din supernatanți și lizate celulare au fost preparate așa cum s-a descris anterior [25].Parametrii de transfer de membrană pentru pro-IL-1p, pro-caspaza-1, caspaza-1 p20, NLRP3, p-actină și His-tag au fost 200 mA/90 min.Pentru interleukina 1β (IL-1β; R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, SUA), caspaza-1 (p20) (Adipogen, Elveția) și NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Elveția) și 1:5000 care vizează eticheta His (Amylet Scientific, Wuhan, China) și β-actină (Proteintech, Wuhan, China).
Legătura încrucișată cu suberat de disuccinimidă (DSS) a fost efectuată așa cum a fost descris anterior [26].Celulele au fost spălate de 3 ori cu PBS rece și lizate complet cu un ac de 27 gauge în 50 ui tampon de reacție ASC (pH 8,0) care conține 25 mM Na2PO4, 187,5 mM NaCI, 25 mM HEPES și 125 mM NaHC03.Amestecul a fost centrifugat la 5000 g timp de 3 minute și peletul a fost suturat cu 10 ui DSS (25 mM în DMSO) și 40 ui tampon de reacție ASC timp de 30 de minute la 37°C.După centrifugare la 5000 g timp de 10 minute, peletul a fost dizolvat într-o soluție de 40 pl de tampon de reacție ASC și 10 pl de tampon de încărcare cu proteine ​​6x (TransGen, Beijing, China), iar apoi soluția a fost stinsă la temperatura camerei timp de 15 min., Apoi se fierbe 10 minute.Probele de proteine ​​au fost apoi supuse Western blot folosind anticorpi anti-ASC primari (Wanleibio, Shenyang, China) la un raport de diluție de 1:500.
Urmând o procedură descrisă anterior [13], supernatanții de cultură celulară au fost recoltați și secreția de citokină proinflamatoare IL-1β a fost determinată folosind kitul ELISA IL-1 Beta de șoarece (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).Convertiți valorile OD450nm în concentrații de proteine ​​folosind curba standard IL-1β.
Celulele acoperite pe lamele au fost spălate ușor de 3 ori în PBS cald, fixate în fixativ de celule tisulare (Biosharp, Beijing, China) timp de 10 minute la temperatura camerei (RT), în 0,1% Triton X-Permeabilize la 100°C (diluat în PBS; Biosharp); ) timp de 20 de minute la temperatura camerei și blocați în albumină serică bovină 5% (în PBS) timp de 2 ore la temperatura camerei.Celulele au fost apoi incubate peste noapte la 4°C cu anticorpi primari împotriva ASC (diluție 1:100) sau NLRP3 (diluție 1:100), respectiv, și IgG anti-iepure de capră marcat Cy3 (H+L) (1:400; EarthOx). , San Francisco, CA, SUA) sau IgG anti-șoarece de capră conjugat cu FITC (1:400; Earthox) peste noapte la 37°C în întuneric timp de 1 oră.Nucleele au fost colorate cu Hoechst 33258 (10 μg/ml; UE, Suzhou, China) timp de 5 minute și observate la microscop cu fluorescență (Olympus Corporation, Tokyo, Japonia).
Șoarecii au fost împărțiți în patru grupuri (n = 7 în fiecare grup): (i) grup martor negativ tratat cu PBS (numai PBS; gavage 100 pl/șoarece PBS urmat de injectare intraperitoneală zilnică 100 pl/șoarece PBS 3 ore mai târziu)., continuu timp de 7 zile);(ii) grupul martor negativ tratat cu inhibitor MCC950 [27] (100 µl/șoarece prin gavaj PBS, 3 ore mai târziu, 10 mg/kg greutate corporală [BW] MCC950 [în PBS] a fost administrat intraperitoneal zilnic, durata 7 zile);(iii) grupul de infecție cu chisturi G. duodenalis (1,5 x 106 chisturi/șoarece prin gavaj, 3 ore mai târziu, 100 μl/șoarece PBS administrat intraperitoneal zilnic timp de 7 zile);(iv) Grupul de infecție combinat chist G. duodenalis Grup de tratament cu inhibitor MCC950 (1,5 x 106 chisturi/șoarece prin gavaj, 10 mg/kg greutate corporală MCC950 intraperitoneal zilnic timp de 7 zile la 3 ore).Greutatea corporală a fiecărui șoarece a fost monitorizată zilnic și toți șoarecii au fost eutanasiați în a 7-a zi.Duodenul recoltat (3 cm lungime) a fost tăiat în bucăți mici în 1 ml PBS, chisturile au fost distruse peste noapte în PBS la 4°C și trofozoiții de G. duodenalis.Duodenul proaspăt (1 cm lungime) a fost izolat pentru colorarea cu hematoxilină și eozină (H&E).
Șoarecii au fost împărțiți în două grupuri: (i) grupul de control MOCK și (ii) grupul inhibitor MCC950.Au existat cinci tratamente în fiecare grup (n = 7/grup de tratament): (i) grup martor negativ tratament cu PBS (numai PBS; 100 µl/șoarece PBS, injecție intramusculară (IM) (tibialis anterior) [28, 29] ;( ii) grup de control negativ plasmid pcDNA3.1(+) (100 ug/ADN de șoarece, prin injecție intramusculară) (iii) grup de control pozitiv al infecției cu chisturi G. duodenalis (1,5 x 106 chisturi/șoarece, prin gavage) (iv) a); grup tratat cu plasmida pcDNA3.1(+)-alfa-2 (100 μg/ADN de șoarece, prin injecție intramusculară) și (v) un grup tratat cu plasmida pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 (100 μg/șoarece ADN, după 12 ore de trecere, șoarecii din grupul inhibitor MCC950 au primit o injecție intraperitoneală zilnică de MCC950 (10 mg/kg greutate corporală) timp de 7 zile, în timp ce șoarecii din grupul MOCK au primit un volum egal de tratament cu PBS. Probele de sânge au fost colectate de la șoarecii globilor oculari și lăsate peste noapte la 4 °C Probele de ser au fost izolate utilizând testul imunosorbent legat de enzime (ELISA) pentru și măsurători ale nivelurilor de IL-1β.
Treizeci și cinci de șoareci au fost împărțiți în cinci grupuri (n=7/grup).Grupul 1 a fost un grup de control negativ tratat cu PBS: șoarecii au primit 100 μl de PBS intramuscular și 3 zile mai târziu prin gavaj.Grupul 2 este un grup de control pozitiv infectat cu chisturi G. duodenalis: șoarecii au fost injectați cu 100 μl de PBS, iar 3 zile mai târziu 1,5 x 106 chisturi/șoarece au fost injectați intragastric.Al treilea grup – imunizarea plasmidă cu pcDNA3.1(+) în combinație cu un grup de control pentru infecția cu chisturi duodenale: șoarecii au primit 100 μg de ADN plasmid pcDNA3.1(+)(im) pe cale orală, 1,5×106 chisturi/șoarece 3 pentru mai multe zile.Grupurile 4 și 5 au fost plasmidă recombinantă pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardină sau plasmidă pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardină în combinație cu infecția cu chist G. duodenalis.Grup experimental: șoarecii au primit 100 ug de pcDNA3.ADN plasmid 1(+)-giardine (im), apoi 3 zile mai târziu, 1,5 × 106 chisturi/șoarece au fost injectate prin gavaj.Greutatea corporală a fiecărui șoarece a fost monitorizată după introducerea chistului G. duodenalis prin tub.Duodenul proaspăt a fost colectat pentru măsurătorile sarcinii parazitare și analiza colorării HE.
Modificările histopatologice au fost analizate conform unei proceduri publicate anterior [30].Duodenul proaspăt a fost fixat cu fixativ de celule tisulare, încorporat în parafină, tăiat în secțiuni de 4 μm, colorat cu H&E și analizat la microscop cu lumină.Modificările patologice reprezentative în șapte secțiuni de țesut de la șapte șoareci independenți au fost evaluate de un patolog care nu cunoaște tratamentul și au fost capturate la o mărire de 200x.Lungimea vilozităților și adâncimea criptelor au fost măsurate în conformitate cu metodele descrise anterior.
Rezultatele in vitro și in vivo au fost obținute în trei exemplare.Graficele au fost generate folosind GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, SUA).Diferențele dintre două grupuri au fost analizate prin testul t, în timp ce diferențele dintre ≥3 grupuri au fost analizate prin analiza unidirecțională a varianței (ANOVA) folosind software-ul SPSS (versiunea 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, SUA).Datele au fost analizate pentru omogenitatea varianței folosind testul Levene urmat de testul post hoc al lui Bonferroni (B).Semnificația este exprimată ca P<0,05, P<0,01 și P<0,001 (nesemnificativ [ns]) (P>0,05).
Analiza noastră anterioară a proteomicii GEV din Enciclopedia Kyoto a Genelor și Genomelor (KEGG) a arătat că multe ținte pot fi implicate în activarea căilor de semnalizare inflamatorie [13].Am selectat două ținte promițătoare, alfa-2 și alfa-7.3 giardine, am amplificat aceste molecule și le-am folosit pentru a construi vectorul de expresie eucariotic pcDNA3.1(+).După secvențiere, plasmidele recombinate de expresie pcDNA3.1(+)-alfa-2 și alfa-7.3 giardină au fost transfectate în macrofage peritoneale primare de șoarece și a fost identificată proteina semnătură caspaza-1 p20 a inflamației (un fragment de caspază-1 activată). ca elucidând molecule cheie care pot declanșa inflamația.Rezultatele au arătat că giardinele alfa-2 și alfa-7.3 pot induce expresia p20 caspaze-1 similară cu GEV.Nu a fost găsit niciun efect asupra activării caspazei-1 în controlul negativ netratat (numai PBS) și controlul plasmidului pcDNA3.1(+) (Figura 1).
Măsurarea activării p20 caspazei-1 prin pcDNA3.1(+)-alfa-2 și alfa-7.3 giardine.Plasmidele recombinante de expresie eucariote pcDNA3.1(+)-alfa-2 și alfa-7.3 giardine (deasupra fiecărei benzi) au fost transfectate în macrofage peritoneale primare de șoarece și supernatanții de cultură au fost recoltați 24 de ore mai târziu.Western blotting a fost folosit pentru a măsura nivelurile de expresie ale proteinei inflamazom caspaze-1 p20 semnătură.Grupul de tratament numai cu PBS (banda C) și grupul de monoterapie pcDNA3.1(+) (banda pcDNA3.1) au fost utilizate ca control negativ, iar grupul de tratament GEV a fost utilizat ca control pozitiv.Expresia proteinei recombinante a fost confirmată prin detectarea unei etichete de histidină în fiecare proteină, iar benzile proteice așteptate au fost alfa-2 giardină (38,2 kDa) și alfa-7,3 giardină (37,2 kDa).GEV, vezicule extracelulare Giardia duodenum, pcDNA3.1(+), vector liniarizat EcoRV, SUP, supernatant
Pentru a determina dacă alfa-2 giardina și alfa-7.3 giardina induc expresia p20 caspaze-1 și joacă un rol în activarea răspunsului inflamator NLRP3 gazdă, pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardine și pcDNA3.1(+)-alfa -7,3 giardin a fost transfectat în macrofage peritoneale primare de șoarece cu ADN plasmid recombinant și s-au determinat nivelurile de expresie, localizare și oligomerizare ale proteinelor inflamatorii cheie NLRP3.În acest experiment, GEV a fost utilizat ca grup de control pozitiv, iar grupul fără tratament (numai PBS) sau grupul de tratament cu transfecție pcDNA3.1(+) a fost grupul negativ.Rezultatele au arătat că, ca și în grupul GEV, ADN-ul plasmid recombinant al giardinei pcDNA3.1(+)-alfa-2 și giardin pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 a dus la reglarea în sus a NLRP3, pro-IL-1β și activarea procaspazei-1 și a caspazei-1 (Fig. 2a).În plus, ambele giardine au indus secreție semnificativă de IL-1β (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,1000; alfa-2 giardine: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0007 ).;alfa-7,3 giardină: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P<0,0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0047) (Figura 2b).Majoritatea proteinelor ASC au fost monomerice în grupul fără tratament sau în grupul de tratament transfectat cu plasmida pcDNA3.1(+), spre deosebire de pcDNA3.1(+)-alfa-2 sau pcDNA3.1(+)-alfa- 7.3 giardină.Oligomerizarea ASC a avut loc în ADN-ul plasmid recombinant al grupului sau grupului martor pozitiv GEV, prezentând o formă oligomerică (Figura 2c).Aceste date preliminare sugerează că alfa-2 giardina și alfa-7,3 giardina pot induce activarea inflamației NLRP3.Studiile imunofluorescente ulterioare ale localizării ASC și NLRP3 au arătat că, în grupul de control negativ, proteina ASC a fost împrăștiată în citoplasmă și a apărut ca un semnal punct la stimularea pcDNA3.1(+)-alfa-2 cu giardină sau pcDNA3.Grupul 1(+)-alfa-7,3 giardină sau grupul de control pozitiv GEV (Figura 2d).În grupurile de control negativ și tratate cu plasmidă pcDNA 3.1, semnalul proteinei NLRP3 nu a fost detectat, în timp ce un punct de semnal fluorescent ca răspuns la giardină pcDNA3.1(+)-alfa-2 sau pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 a fost detectat..giardine se găsesc în citoplasmă sau la stimularea HEV (Fig. 2e).Aceste date demonstrează în plus că G. duodenalis giardin alfa-2 și giardin alfa-7.3 activează inflamazomul NLRP3 în macrofagele peritoneale primare de șoarece.
pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin și pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardin activează inflamazomul NLRP3 în macrofagele peritoneale de șoarece.Transfectați plasmidele recombinate de expresie eucariote pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin și pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardin în macrofage și celule peritoneale murine primare sau recoltați supernatantul în 24 de ore pentru analiza expresiei, oligomerizării , secretie.și localizarea proteinelor inflamatorii cheie.Grupul numai cu PBS (C) și grupul de tratament unic pcDNA3.1(+) au fost utilizate ca control negativ, iar grupul de tratament GEV a fost utilizat ca grup pozitiv.a Proteinele inflamatorii cheie NLRP3, inclusiv NLRP3, pro-IL-1β, pro-caspaza-1 și p20 caspaza-1, au fost detectate prin Western blot.b Nivelurile de secreție de IL-1p în supernatanți au fost determinate utilizând testul imunosorbent legat de enzime (ELISA).Diferențele dintre grupurile de control și cele experimentale au fost analizate prin analiza unidirecțională a varianței (ANOVA) folosind software-ul SPSS versiunea 22.0.Asteriscurile indică diferențe semnificative între grupurile **P<0,01 și ***P<0,001.c Nivelurile de oligomerizare ASC în pelete au fost determinate prin analiza de reticulare DSS, în timp ce nivelurile ASC din lizatele celulare au fost utilizate ca control de încărcare.d Vizualizarea localizării ISC folosind imunofluorescență.e Imunofluorescența a fost utilizată pentru a vizualiza localizarea NLRP3.ASC, proteină asemănătoare petei apoptotice;IL, interleukină;NLRP3, receptorul 3 asemănător oligomerizării de legare a nucleotidelor;ns, nesemnificativ (P > 0,05)
Atât G. duodenalis, cât și GEV-urile pe care le secretă activează inflamazomul NLRP3 și reglează răspunsurile inflamatorii ale gazdei in vitro.Astfel, rolul inflamazomului NLRP3 în patogenitatea G. duodenalis rămâne neclar.Pentru a investiga această problemă, am proiectat un experiment între șoareci infectați cu chist G. duodenalis și șoareci infectați cu chist G. duodenalis + tratament cu inhibitor MCC950 și am comparat expresia inflamasomului NLRP3 atunci când au fost infectați cu chist G. duodenalis.O schemă detaliată a experimentului este prezentată în Fig. 3a.Modificările în greutatea corporală a șoarecilor din diferite grupuri de tratament au fost monitorizate timp de 7 zile după infectarea cu chisturi, iar rezultatele sunt prezentate în Fig. 3b.Comparativ cu grupul tratat cu PBS pur, rezultatele au arătat că (i) greutatea corporală a șoarecilor infectați cu chistul G. duodenalis a scăzut din ziua 3 până în ziua 7 după infecție;(ii) tratamentul cu inhibitorul MCC950 nu a avut un efect semnificativ asupra greutății corporale a șoarecilor..Comparativ cu grupul cu infecție unică, BW al grupului cu infecție duodenală tratat cu MCC950 a scăzut în diferite grade (Ziua 1: ANOVA, F(3, 24) = 1,885, P = 0,0148; Ziua 2: ANOVA, F(3, 24) ) = 0,4602, P<0,0001: ANOVA, F(3, 24) = 0,8360, P = 0,0010: ANOVA, F(3, 24) = 1,683, P = 0,0052, F (3, 24)=0,6497, P=0,0645: ANOVA, F(3, 24)=5,457, P=0,0175: ANOVA, F(3, 24) = 2,893, P = 0,0202;Aceste date demonstrează că inflamazomul NLRP3 protejează șoarecii de pierderea semnificativă în greutate în stadiile incipiente (2-4 zile) ale infecției duodenale.Apoi am urmărit să detectăm trofozoiții G. duodenalis în lichidul de spălare duodenală, iar rezultatele sunt prezentate în Figura 3c.Comparativ cu grupul de infecție cu chisturi G. duodenalis, numărul de trofozoiți din duoden a crescut semnificativ după blocarea inflamazomului NLRP3 (t(12) = 2,902, P = 0,0133).Țesuturile duodenale colorate cu HE au arătat, în comparație cu controlul negativ tratat cu PBS și MCC950 singur: (i) infecția cu chisturi cu G. duodenalis a dus la deteriorarea vilozităților duodenale (ANOVA, F(3, 24)=0,4903, P=0,0488 ) și atrofia criptei (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0,0089);(ii) duoden de la șoareci infectați cu chisturi G. duodenalis și tratați cu inhibitori MCC950.vilozitățile duodenale au fost deteriorate și moarte (ANOVA, F(3, 24) = 0,4903, P = 0,0144) cu atrofie și ramificare a criptei (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0, 0481) (Fig. 3d- f) .Aceste rezultate sugerează că inflamazomul NLRP3 joacă un rol în reducerea patogenității G. duodenalis.
Rolul inflamazomului NLRP3 în infecția cu Giardia duodenum.Șoarecii au fost gavageți (iv) cu chisturi duodenococice și apoi tratați cu sau fără MCC950 (ip).Grupuri de tratament unic cu PBS sau MCC950 au fost utilizate ca martori.Grup experimental și regim de tratament.b Greutatea corporală a șoarecilor din fiecare dintre diferitele grupuri de tratament a fost monitorizată timp de 7 zile.Diferența dintre grupul de infecție cu G. duodenalis și grupul de tratare a infecției cu G. duodenalis + MCC950 a fost analizată prin testul t folosind software-ul SPSS versiunea 22.0.Asteriscurile indică diferențe semnificative la *P<0,05, **P<0,01 sau ***P<0,001.c Sarcina parazitară a fost determinată prin numărarea numărului de trofozoiți din lichidul de spălare duodenală.Diferența dintre grupul de infecție cu G. duodenalis și grupul de tratare a infecției cu G. duodenalis + MCC950 a fost analizată prin testul t folosind software-ul SPSS versiunea 22.0.Asteriscurile indică diferențe semnificative la *P < 0,05.d Rezultatele colorării cu hematoxilină și eozină (H&E) ale histopatologiei duodenale.Săgețile roșii indică deteriorarea vilozităților, săgețile verzi indică deteriorarea criptelor.Bară de scară: 100 µm.e, f Analiza statistică a înălțimii vilozităților duodenale și a înălțimii criptei șoarecelui.Asteriscurile indică diferențe semnificative la *P<0,05 și **P<0,01.Rezultatele sunt preluate din 7 experimente biologice independente.BW, greutatea corporală;ig, calea de livrare intragastrică;ip, cale de livrare intraperitoneală;ns, nesemnificativ (P > 0,05);PBS, soluție salină tamponată cu fosfat;WT, tip sălbatic
Secreția de IL-1β este un semn distinctiv al activării inflamației.Pentru a determina dacă G. duodenalis alfa-2 giardine și alfa-7.3 giardine activează inflammazomul gazdă NLRP3 in vivo, am folosit șoareci WT netrați (grup simulat) și șoareci blocați cu inflamazom NLRP3 (grupul de tratament inhibat MCC950).O schemă detaliată a experimentului este prezentată în Fig. 4a.Grupurile experimentale au constat din șoareci tratați cu PBS, tratament cu chist G. duodenalis prin gavaj, injectare intramusculară de pcDNA3.1 și injectare intramusculară de pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardină sau pcDNA3.1-alfa-7.3 giardină.În a 7-a zi după administrarea intramusculară a plasmidei recombinate, a fost colectat serul şi a fost determinat nivelul IL-1p din fiecare grup.După cum se arată în Figura 4b, în ​​grupul MOCK: (i) în comparație cu grupul PBS, tratamentul cu pcDNA3.1 nu a avut un efect semnificativ asupra secreției de IL-1β (ANOVA, F(4,29)=4,062, P=0,9998), totuși, Secreția IL-β a fost semnificativ crescută în grupul cu chist G. duodenalis (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P = 0,0002), (ii) pcDNA3.1-alfa-2 giardină și pcDNA3.1- Injectarea intramusculară de alfa-7,3 giardină a crescut semnificativ nivelurile serice de IL-1β (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P<0,0001);(iii) pcDNA3.1-alfa-7,3 giardine a indus niveluri ridicate de secreție de IL-1β în grupul de injecție intramusculară pcDNA3.1-alfa-2 giardină (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P = 0,0333) .Comparativ cu fiecare grup din grupul de tratament MCC950 și grupul MOCK: (i) nivelurile de secreție de IL-1β în grupul de control PBS și grupul de control pcDNA3.1 au scăzut într-o anumită măsură după blocarea inhibitorului MCC950, dar diferența nu a fost semnificativ (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3,540, P = 0,4912 pcDNA3.1: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,5949);(ii) după blocarea MCC950., secreția de IL-1β a fost redusă semnificativ în grupul infectat cu chisturi G. duodenalis, grupul giardină pcDNA3.1-alfa-2 și grupul giardină pcDNA3.1-alfa-7.3 (G. duodenalis: ANOVA, F(9) , 58) = 3,540, P = 0,0120 pcDNA3,1-alfa-2 giardină: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,0447 pcDNA3,1-alfa-7,3 giardină: ANOVA, F(9, 58); ) = 3,540, P = 0,0164).Aceste rezultate sugerează că alfa-2 giardina și alfa-7.3 giardina mediază activarea inflamazomului NLRP3 in vivo.
pcDNA3.1(+)-giardine activează inflamazomul gazdă NLRP3 in vivo.Șoarecii au fost imunizați (IM) cu plasmida recombinantă de expresie eucariotă pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardină sau pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardină și apoi tratați cu MCC950 (ip; grupa MCC950) sau nu (grup inactiv ).Grupul de tratament cu plasmidă PBS sau pcDNA3.1(+) a fost utilizat ca martor negativ, grupul de tratament cu chist G. duodenalis a fost utilizat ca control pozitiv.Grup experimental și regim de tratament.b Nivelurile serice de IL-1p la șoareci au fost măsurate în ziua 7 prin test ELISA.Diferențele dintre grupurile din grupul MOCK au fost analizate folosind ANOVA unidirecțional, iar diferențele dintre grupul MOCK și grupul MCC950 au fost analizate folosind testul t al software-ului SPSS versiunea 22.0.Asteriscurile indică diferențe semnificative între grupurile de tratament din grupul MOCK, *P<0,05 și ***P<0,001;semnele dolarului ($) indică diferențe semnificative între fiecare grup din grupul MOCK și grupul MCC950 la P<0,05.Rezultatele a șapte experimente biologice independente.i, injecție intramusculară, ns, nesemnificativ (P > 0,05)
Pentru a investiga efectul activării mediate de alfa-2 și alfa-7.3 giardină a inflammazomului gazdă NLRP3 asupra infecțiozității G. duodenalis, am folosit șoareci WT C57BL/6 și am injectat alfa-2 giardină și alfa-7.3 giardine.plasmida a fost injectată intramuscular, după 3 zile prin tubul gastric al chistului G. duodenalis, după care șoarecii au fost observați timp de 7 zile.O schemă detaliată a experimentului este prezentată în Fig. 5a.Greutatea corporală a fiecărui șoarece a fost măsurată în fiecare zi, au fost colectate probe de țesut duodenal proaspăt în a 7-a zi după administrare printr-o sondă gastrică, a fost măsurat numărul de trofozoiți și au fost observate modificări histopatologice.După cum se arată în Figura 5b, odată cu creșterea timpului de hrănire, BW-ul șoarecilor din fiecare grup a crescut treptat.MT de șoareci a început să scadă în a 3-a zi după administrarea intragastrică a chisturilor G. duodenalis, iar apoi a crescut treptat.Activarea inflamazomului NLRP3 indusă prin injectarea intramusculară de alfa-2 giardină și alfa7.3 giardină a atenuat semnificativ pierderea în greutate la șoareci (Ziua 1: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 1.399, P = 0,9754 Ziua 1: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardină, ANOVA, F(4, 30)=1,399, P=0,9987 Ziua 2: pcDNA3.1-alfa-2 giardină, ANOVA, F(4, 30) = 0,3172, P = 0,9979 Ziua 2: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,3172, P = 0,8409: pcDNA3.1-alfa-2 giardine, ANOVA; 4, 30) = 0,8222, P = 0,0262 Ziua 3: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardină, ANOVA, F(4, 30) = 0,8222, P = 0,0083 Ziua 4: pcDNA3.1-alfa-2 giardină; , F(4, 30) = 0,5620, P = 0,0012, Ziua 4: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardină, ANOVA, F(4, 30) = 0.5620, P < 0.0001, Ziua 5: pcDNA3.1-alfa - 2 giardină, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 Ziua 5: pcDNA3.1-alfa -7.3 giardină, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P < 0.0001 Ziua 6: pcDNA3 .1 - alfa-2 giardină, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0012, Ziua 6: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0006;Ziua 7: pcDNA3.1-alfa-2 giardină, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P<0,0001 Ziua 7: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardină, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P <0,0001).Încărcarea parazitară a fost evaluată în duoden (Fig. 5c).În comparație cu controlul pozitiv netratat și cu grupul injectat cu vectorul pcDNA3.1 gol, numărul de trofozoiți G. duodenalis a fost redus semnificativ la grupurile injectate cu α-2 giardină și α-7,3 giardină (pcDNA3.1-alfa). -2 giardină: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0002, pcDNA3.1-alfa-7,3 giardină: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P<0,0001).În plus, giardina alfa-7.3 a fost mai protectoare la șoareci decât giardina alfa-2 (ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0081).Rezultatele colorării HE sunt prezentate în fig.5d–f.Șoarecii injectați cu alfa-2 giardine și alfa-7.3 giardine au avut mai puține leziuni ale țesutului duodenal, manifestate prin afectarea vilozităților, comparativ cu șoarecii injectați cu G. duodenalis și șoarecii injectați cu G. duodenalis în combinație cu un vector pcDNA3 gol .1 Zoom.(pcDNA3.1-alfa-2 giardină: ANOVA, F(3, 24) = 2,466, P = 0,0035 sau P = 0,0068; pcDNA3.1-alfa-7,3 giardină: ANOVA, F(3, 24) = 2,466, P = 0,0028 sau P = 0,0055) și atrofie redusă a criptei (pcDNA3.1-alfa-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1,470, P = 0,0264 sau P = 0,0158; pcDNA3.1-alfa-7,3 giardine: ANOVA , F(3, 24) = 1,470, P = 0,0371 sau P = 0,0191).Aceste rezultate sugerează că alfa-2 giardina și alfa-7,3 giardina reduc infectivitatea G. duodenalis prin activarea inflamazomului NLRP3 in vivo.
Rolul pcDNA3.1(+)-giardines în infecția cu G. duodenalis.Șoarecii au fost imunizați (IM) cu plasmide de expresie eucariote recombinante pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardină sau pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardine și apoi provocați cu chisturi G. duodenalis (ig).Grupul PBS și grupul pcDNA3.1(+) + tratament cu chist duodenal au fost utilizate ca grupuri de control negativ, iar grupul cu tratament cu chist duodenal a fost utilizat ca grup de control pozitiv.Grup experimental și regim de tratament.b MT de șoareci din fiecare dintre diferitele grupuri de tratament a fost monitorizată timp de 7 zile după provocare.Asteriscurile indică diferențe semnificative între grupurile din grupul G. duodenalis și din grupul pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardină, *P <0,05, **P <0,01 și ***P <0,001;semnul dolarului ($) indică o diferență semnificativă între fiecare grup de G. duodenalis și grupul pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 jardine, $$P<0,01 și $$$P<0,001.c Încărcarea parazită a fost determinată prin numărarea numărului de trofozoiți în 1 ml de lavaj duodenal din duoden (3 cm lungime) și exprimată ca număr de paraziți per cm de duoden.Diferențele dintre grupul de infecție cu G. duodenalis, grupul pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardine și grupul pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardine au fost analizate prin ANOVA unidirecțional utilizând versiunea software SPSS 22.0.Asteriscurile indică diferențe semnificative la **P<0,01 și ***P<0,001.d Modificări histopatologice la nivelul duodenului.Săgețile roșii indică deteriorarea vilozităților, săgețile verzi indică deteriorarea criptelor.Bară de scară: 100 µm.e, f Analiza statistică a înălțimii vilozităților duodenale de șoarece (e) și a înălțimii criptei (f).Diferențele dintre grupuri din Figura 1d au fost analizate prin ANOVA unidirecțională folosind software-ul SPSS versiunea 22.0.Asteriscurile indică diferențe semnificative la *P<0,05 și **P<0,01.Rezultatele a șapte experimente biologice independente.ns, nesemnificativ (P > 0,05)
Giardia duodenum este un parazit intestinal binecunoscut al oamenilor și al altor mamifere care provoacă giardioza.În 2004, a fost inclusă în Inițiativa OMS privind bolile neglijate datorită prevalenței sale mari pe 6 ani, în special în comunitățile cu statut socio-economic scăzut [32].Sistemul imunitar înnăscut joacă un rol critic în răspunsul imun la infecția cu G. duodenalis.S-a raportat că macrofagele de șoarece înghit și ucid G. duodenalis prin eliberarea capcanelor extracelulare [33].Studiile noastre anterioare au arătat că G. duodenalis, un parazit extracelular neinvaziv, activează căile de semnalizare inflamatorie p38 MAPK, ERK, NF-κB p65 și NLRP3 în macrofagele de șoarece pentru a regla răspunsurile inflamatorii ale gazdei, iar GEV eliberat poate îmbunătăți acest proces.13], 24].Cu toate acestea, PAMP-urile exacte implicate în inflamația reglată de inflamazomul NLRP3 în GEV și rolul inflamazomului NLRP3 în giardioză rămân de elucidat.Pentru a face lumină asupra acestor două întrebări, am realizat acest studiu.
Inflamazomul NLRP3 este localizat în citoplasma celulelor imune și poate fi activat de diferite particule, cum ar fi cristale de acid uric, toxine, bacterii, viruși și paraziți.În studiile bacteriene, toxinele au fost identificate ca PAMP-uri cheie care activează senzorii inflamatori, ducând la inflamație și moartea celulelor [34].Unele toxine structural diverse, cum ar fi hemolizina din Staphylococcus aureus [35] și Escherichia coli [36], hemolizina BL (HBL) din enterotoxina (NHE) [37], induc activarea inflamației NLRP3.Studiile virale au arătat că proteinele de virulență, cum ar fi proteina învelișului SARS-COV-2 (E) [38] și proteina NS5 a virusului Zika [39] sunt PAMP importante recunoscute de receptorul NLRP3.În studiile cu paraziți, s-a raportat că mulți paraziți sunt asociați cu activarea inflamazomului gazdei, cum ar fi Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41] și Leishmania [42].Proteinele granulate dense GRA35, GRA42 și GRA43, asociate cu virulența Toxoplasma gondii, sunt necesare pentru inducerea piroptozei la macrofagele de șobolan Lewis [43].În plus, unele studii Leishmania s-au concentrat pe moleculele individuale implicate în inflamazomul NLRP3, cum ar fi lipofosfoglicanul membranar al parazitului [44] sau metaloproteaza de zinc [45].Printre familia de gene alfa-giardin asemănătoare anexinei, alfa-1 giardin s-a dovedit a fi un potențial candidat la vaccin care oferă protecție împotriva G. duodenalis într-un model de șoarece [18].În studiul nostru, am selectat factorii de virulență G. duodenalis alfa-2 și alfa-7,3 giardine, care sunt unice pentru giardia, dar relativ mai puțin raportate.Aceste două gene țintă au fost donate în vectorul sistemului de expresie eucariotic pcDNA3.1(+) pentru analiza activării inflamației.
În modelul nostru de șoarece, fragmentele de caspază scindate servesc ca markeri ai activării inflamatorii.La stimulare, NLRP3 interacționează cu ASC, recrutează procaspaze și generează caspaze active care scindează pro-IL-1β și pro-IL-18 în IL-1β și IL-18 mature, respectiv -18.Caspazele inflamatorii (caspaze-1, -4, -5 și -11) sunt o familie conservată de cistein-proteaze care sunt critice pentru apărarea înnăscută și sunt implicate în inflamație și moartea celulară programată [46].Caspaza-1 este activată de inflamazomii canonici [47], în timp ce caspazele-4, -5 și -11 sunt scindate în timpul formării inflamazomilor atipici [48].În acest studiu, am folosit macrofage peritoneale de șoarece ca model și am investigat p20 caspaza-1 scindată caspaza-1 ca marker al activării inflamației gazdei NLRP3 în studiile infecției cu G. duodenalis.Rezultatele au arătat că multe alfa-giardine sunt responsabile pentru activarea tipică a inflamației, ceea ce este în concordanță cu descoperirea moleculelor cheie de virulență implicate în bacterii și viruși.Cu toate acestea, studiul nostru este doar un ecran preliminar și există și alte molecule care pot activa inflamazomii neclasici, deoarece studiul nostru anterior a descoperit atât inflamazomi clasici, cât și neclasici în infecția cu G. duodenalis [13].Pentru a determina în continuare dacă p20 caspaza-1 generată este asociată cu inflamazomul NLRP3, am transfectat giardine alfa-2 și alfa-7.3 în macrofage peritoneale de șoarece pentru a determina nivelurile de expresie a proteinei moleculei cheie și nivelurile de oligomerizare ASC, confirmând că ambele α-giardine se activează. inflamazomul NLRP3.Rezultatele noastre sunt ușor diferite de cele ale lui Manko-Prykhoda și colab., care au raportat că stimularea celulelor Caco-2 numai cu tulpini EPEC de G. muris sau E. coli poate crește intensitatea fluorescenței NLRP3, ASC și caspaza-1, deși nu semnificativ, în timp ce costimularea G. muris și E. coli a crescut nivelul a trei proteine ​​[49].Această discrepanță se poate datora diferențelor în selecția speciilor Giardia, liniilor celulare și celulelor primare.De asemenea, am efectuat teste in vivo folosind MCC950 la șoareci WT C57BL/6 femele de 5 săptămâni, care sunt mai sensibili la G. duodenalis.MCC950 este un inhibitor puternic și selectiv de moleculă mică NLRP3 care blochează activarea canonică și necanonică a NLRP3 la concentrații nanomolare.MCC950 inhibă activarea NLRP3, dar nu afectează activarea căilor inflamatorii AIM2, NLRC4 și NLRP1 sau a căilor de semnalizare TLR [27].MCC950 blochează activarea NLRP3, dar nu inhibă inițierea NLRP3, efluxul K+, influxul Ca2+ sau interacțiunea dintre NLRP3 și ASC;în schimb, inhibă activarea inflamazomului NLRP3 prin blocarea oligomerizării ASC [27].Prin urmare, am folosit MCC950 într-un studiu in vivo pentru a determina rolul inflamazomului NLRP3 după injectarea de giardină.Caspaza-1 p10 activată scindează citokinele pro-inflamatorii pro-IL-1β și pro-IL-18 în IL-1β și IL-18 mature [50].În acest studiu, nivelurile serice de IL-1β la șoarecii tratați cu giardină cu sau fără MCC950 au fost utilizate ca indicator al faptului că inflamazomul NLRP3 a fost activat.După cum era de așteptat, tratamentul cu MCC950 a redus semnificativ nivelurile serice de IL-1β.Aceste date demonstrează în mod clar că G. duodenalis giardin alfa-2 și giardin alfa-7.3 sunt capabile să activeze inflamazomul de șoarece NLRP3.
Date semnificative acumulate în ultimul deceniu au demonstrat că IL-17A este regulatorul principal al imunității împotriva G. muris, inducând semnalizarea IL-17RA, producând peptide antimicrobiene și reglând activarea complementului [51].Cu toate acestea, infecția cu Giardia apare mai frecvent la adulții tineri și s-a raportat că infecția cu Giardia la șoarecii tineri nu activează răspunsul IL-17A pentru a-și exercita efectul protector [52], determinând cercetătorii să caute alte Giardia imunomodulatoare.mecanismele infecției cu helminți.Autorii unui studiu recent au raportat că G. muris poate activa inflamazomul NLRP3 de către E. coli EPEC, care promovează producerea de peptide antimicrobiene și reduce capacitatea sa de atașare și numărul de trofozoiți din tractul intestinal, reducând astfel severitatea colonului. boli cauzate de bacili [49].Inflamazomul NLRP3 este implicat în dezvoltarea diferitelor boli.Studiile au arătat că Pseudomonas aeruginosa declanșează autofagia în macrofage pentru a evita moartea celulelor, iar acest proces depinde de activarea inflamazomului NLRP3 [53].Pentru N. caninum, activarea mediată de specii reactive de oxigen a inflamazomului NLRP3 limitează replicarea acestuia în gazdă, făcându-l o țintă terapeutică potențială [9].S-a descoperit că Paracoccidioides brasiliensis induce activarea inflamazomului NLRP3 în celulele dendritice derivate din măduva osoasă de șoarece, rezultând eliberarea citokinei inflamatorii IL-1β, care joacă un rol critic în apărarea gazdei [10].Mai multe specii de Leishmania, inclusiv L. amazonensis, L. major, L. braziliensis și L. infantum chagasi, activează NLRP3 și caspaza-1 dependentă de ASC în macrofage, precum și infecția cu Leishmania.Replicarea paraziților este îmbunătățită la șoarecii cu deficit de gena NLRP3/ASC/caspase-1 [11].Zamboni et al.S-a raportat că infecția cu Leishmania induce activarea inflamazomului NLRP3 în macrofage, ceea ce limitează replicarea intracelulară a paraziților.Astfel, Leishmania poate inhiba activarea NLRP3 ca strategie de evitare.În studiile in vivo, inflamazomul NLRP3 a contribuit la eliminarea Leishmania, dar nu a afectat țesuturile [54].În schimb, în ​​studiile privind helmintiaza, activarea inflamazomului NLRP3 a suprimat imunitatea protectoare a gazdei împotriva helmintiazelor gastrointestinale [12].Shigella este una dintre principalele bacterii care cauzează diaree la nivel mondial.Aceste bacterii pot induce producția de IL-1β prin efluxul K+ mediat de receptorul P2X7, specii reactive de oxigen, acidificare lizozomală și leziuni mitocondriale.Inflamazomul NLRP3 reglează negativ fagocitoza și activitatea bactericidă a macrofagelor împotriva Shigella [55].Studiile cu Plasmodium au arătat că șoarecii cu deficit de AIM2, NLRP3 sau caspază-1 infectați cu Plasmodium produc niveluri ridicate de interferon de tip 1 și sunt mai rezistenți la infecția cu Plasmodium [56].Cu toate acestea, rolul alfa-2 giardinei și al alfa-7.3 giardinei în inducerea activării patogene a inflamației NLRP3 la șoareci este neclar.
În acest studiu, inhibarea inflamazomului NLRP3 de către MCC950 a redus BW și a crescut numărul de trofozoiți în lichidul de lavaj intestinal la șoareci, ducând la modificări patologice mai severe în țesutul duodenal.Giardina alfa-2 și giardina alfa-7.3 activează inflamazomul NLRP3 al șoarecelui gazdă, măresc greutatea corporală a șoarecelui, reduc numărul de trofozoiți din lichidul de lavaj intestinal și ameliorează leziunile patologice duodenale.Aceste rezultate sugerează că G. duodenalis poate activa inflamazomul gazdă NLRP3 prin alfa-2 giardine și alfa-7,3 giardine, reducând patogenitatea G. duodenalis la șoareci.
În mod colectiv, rezultatele noastre demonstrează că giardinele alfa-2 și alfa-7.3 induc activarea inflamazomului gazdă NLRP3 și reduc infecțiozitatea G. duodenalis la șoareci.Prin urmare, aceste molecule sunt ținte promițătoare pentru prevenirea giardiozei.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS, Liang AAM, Huang AHC, Sergi KM, Kam JKM.Giardioza: o privire de ansamblu.Recent a fost dezvăluit că Pat Inflamm este alergic la medicamente.2019;13:134–43.
Escobedo AA, Tsimerman S. Giardioza: o revizuire a farmacoterapiei.Opinia expertului unui farmacist.2007;8: 1885–902.
Tian Huafeng, Chen Bin, Wen Jianfeng.Giardioza, rezistența la medicamente și descoperirea de noi ținte.Infectează ținte medicamentoase Disord.2010;10:295–302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T etc. NLRP3 inflamazom și boli inflamatorii.Oxide Med Cell Longev.2020;2020:4063562.
Chen GY, Núñez G. Rolul inflamazomului în inflamația intestinală și cancer.Gastroenterologie.2011;141:1986–99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. Activarea inflamasomului NLRP3 canonic și atipic la intersecția toleranței imune și a inflamației intestinale.preimune.2017;8:36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S și colab.Activarea inflamazomului NLRP3 mediată de ROS este implicată ca răspuns la infecția cu N. caninum.Vector parazit.2020;13:449.