Vă mulțumim că ați vizitat Nature.com.Versiunea de browser pe care o utilizați are suport limitat pentru CSS.Pentru cea mai bună experiență, vă recomandăm să utilizați un browser actualizat (sau să dezactivați Modul de compatibilitate în Internet Explorer).Între timp, pentru a asigura suport continuu, vom reda site-ul fără stiluri și JavaScript.
Toxoplasma gondii este un parazit protozoar intracelular care modulează micromediul gazdei infectate și se știe că este asociat cu incidența creșterii tumorii cerebrale.În acest studiu, emitem ipoteza că miRNA-21 exosomal din infecția cu Toxoplasma promovează creșterea tumorii cerebrale.Exozomii din microglia BV2 infectată cu Toxoplasma au fost caracterizați și a fost confirmată internalizarea celulelor gliomului U87.Profilurile de expresie a microARN exosomal au fost analizate folosind rețele de microARN și microARN-21A-5p asociate cu Toxoplasma gondii și sortarea tumorilor.De asemenea, am investigat nivelurile de ARNm ale genelor asociate tumorilor din celulele de gliom U87 prin modificarea nivelurilor de miR-21 din exozomi și efectul exozomilor asupra proliferării celulelor de gliom U87 uman.În exozomii celulelor de gliom U87 infectate cu Toxoplasma gondii, expresia microARN-21 este crescută și activitatea genelor antitumorale (FoxO1, PTEN și PDCD4) este redusă.Exozomii derivați de BV2 infectați cu Toxoplasma induc proliferarea celulelor gliomului U87.Exozomii induc creșterea celulelor U87 într-un model de tumoră de șoarece.Sugerăm că creșterea miR-21 exosomală în microglia BV2 infectată cu Toxoplasma poate juca un rol important ca promotor al creșterii celulare în celulele gliomului U87 prin reglarea în jos a genelor antitumorale.
Se estimează că peste 18,1 milioane de cazuri de cancer avansat au fost diagnosticate la nivel mondial în 2018, cu aproximativ 297.000 de tumori ale sistemului nervos central diagnosticate în fiecare an (1,6% din toate tumorile)1.Cercetările anterioare au arătat că factorii de risc pentru dezvoltarea tumorilor cerebrale umane includ diverse produse chimice, antecedente familiale și radiații ionizante de la echipamentele terapeutice și de diagnosticare ale capului.Cu toate acestea, cauza exactă a acestor afecțiuni maligne este necunoscută.Aproximativ 20% din toate cancerele din lume sunt cauzate de agenți infecțioși, inclusiv viruși, bacterii și paraziți3,4.Agenții patogeni infecțioși perturbă mecanismele genetice ale celulei gazdă, cum ar fi repararea ADN-ului și ciclul celular, și pot duce la inflamație cronică și deteriorarea sistemului imunitar5.
Agenții infecțioși asociați cu cancerul uman sunt cei mai frecventi agenți patogeni virali, inclusiv papilomavirusurile umane și virusurile hepatitei B și C.Paraziții pot juca, de asemenea, un rol potențial în dezvoltarea cancerului uman.Mai multe specii de paraziți, și anume Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis și Hymenolepis nana, au fost implicate în diferite tipuri de cancer uman 6,7,8.
Toxoplasma gondii este un protozoar intracelular care reglează micromediul celulelor gazdă infectate.Se estimează că acest parazit infectează aproximativ 30% din populația lumii, punând întreaga populație în pericol9,10.Toxoplasma gondii poate infecta organe vitale, inclusiv sistemul nervos central (SNC), și poate provoca boli grave, cum ar fi meningita și encefalita letale, în special la pacienții imunodeprimați9.Cu toate acestea, Toxoplasma gondii poate modifica și mediul gazdei infectate prin modularea creșterii celulare și a răspunsurilor imune la indivizii imunocompetenți, ceea ce duce la menținerea unei infecții cronice asimptomatice9,11.Interesant, având în vedere corelația dintre prevalența T. gondii și incidența tumorii cerebrale, unele rapoarte sugerează că schimbările de mediu ale gazdei in vivo datorate infecției cronice cu T. gondii seamănă cu micromediul tumoral.
Exozomii sunt cunoscuți ca comunicatori intercelulari care furnizează conținut biologic, inclusiv proteine ​​și acizi nucleici, de la celulele învecinate16,17.Exozomii pot influența procesele biologice legate de tumoră, cum ar fi anti-apoptoza, angiogeneza și metastaza în micromediul tumoral.În special, miARN-urile (miARN-urile), ARN-uri mici necodificatori cu o lungime de aproximativ 22 de nucleotide, sunt regulatori ai genelor post-transcripționale importanți care controlează mai mult de 30% din ARNm uman prin complexul de tăcere indus de miARN (miRISC).Toxoplasma gondii poate perturba procesele biologice prin controlul expresiei miARN la gazdele infectate.MiARN-urile gazdei conțin semnale importante pentru reglarea proceselor biologice ale gazdei pentru a realiza strategia de supraviețuire a parazitului.Astfel, studierea modificărilor profilului miARN al gazdei la infecția cu T. gondii ne poate ajuta să înțelegem mai clar interacțiunea dintre gazdă și T. gondii.Într-adevăr, Thirugnanam și colab.15 a sugerat că T. gondii promovează carcinogeneza creierului prin modificarea expresiei sale asupra miARN-urilor gazdă specifice asociate cu creșterea tumorii și a constatat că T. gondii poate provoca glioame la animalele experimentale.
Acest studiu se concentrează pe alterarea miR-21 exosomal în microglia gazdă infectată cu Toxoplasma BV2.Am observat un posibil rol al miR-21 exosomal alterat în creșterea celulelor gliomului U87 datorită reținerii în nucleul lui FoxO1/p27, care este ținta miR-21 supraexprimat.
Exozomii derivați din BV2 au fost obținuți prin centrifugare diferențială și validați prin diferite metode pentru a preveni contaminarea cu componente celulare sau alte vezicule.Electroforeza pe gel SDS-poliacrilamidă (SDS-PAGE) a arătat modele distincte între proteinele extrase din celulele BV2 și exozomi (Figura 1A), iar probele au fost evaluate pentru prezența Alix, care a fost analizată prin Western blotting a markerilor de proteine ​​exosomale în .Marcarea cu Alix a fost găsită în proteinele exozomale, dar nu și în proteinele lizate de celule BV2 (Fig. 1B).În plus, ARN-ul purificat din exozomi derivați din BV2 a fost analizat utilizând un bioanalizator.Subunitățile ribozomale 18S și 28S au fost rar observate în modelul de migrare a ARN exosomal, indicând o puritate de încredere (Figura 1C).În cele din urmă, microscopia electronică cu transmisie a arătat că exozomii observați aveau o dimensiune de aproximativ 60-150 nm și aveau o structură asemănătoare cupei, tipică morfologiei exozomilor (Fig. 1D).
Caracterizarea exosomilor derivați din celulele BV2.(A) Pagina cu fișa cu date de securitate.Proteinele au fost izolate din celulele BV2 sau exozomii derivați din BV2.Modelele proteice diferă între celule și exozomi.(B) Analiza Western blot a unui marker exosomal (Alix).(C) Evaluarea ARN-ului purificat din celulele BV2 și exozomii derivați de BV2 folosind un bioanalizator.Astfel, subunitățile ribozomale 18S și 28S din celulele BV2 au fost rareori găsite în ARN-ul exosomal.(D) Microscopia electronică cu transmisie a arătat că exozomii izolați din celulele BV2 au fost colorați negativ cu acetat de uranil 2%.Exozomii au o dimensiune de aproximativ 60-150 nm și au formă de cupă (Song și Jung, date nepublicate).
Interiorizarea celulară a exozomilor derivați de BV2 în celulele de gliom uman U87 a fost observată utilizând microscopia confocală.Exozomii marcați cu PKH26 sunt localizați în citoplasma celulelor U87.Nucleii au fost colorați cu DAPI (Fig. 2A), indicând faptul că exozomii derivați de BV2 pot fi interiorizați de celulele gazdă și pot influența mediul celulelor primitoare.
Internalizarea exozomilor derivați de BV2 în celulele de gliom U87 și exozomilor derivați de BV2 infectați cu Toxoplasma RH a indus proliferarea celulelor de gliom U87.(A) Exozomi înghițiți de celulele U87 măsurați prin microscopie confocală.Celulele de gliom U87 au fost incubate cu exozomi marcați cu PKH26 (roșu) sau fără control timp de 24 de ore.Nucleele au fost colorate cu DAPI (albastru) și apoi observate la microscop confocal (bară de scară: 10 μm, x 3000).(B) Proliferarea celulelor de gliom U87 a fost determinată prin testul de proliferare celulară.Celulele de gliom U87 au fost tratate cu exozomi pentru timpul indicat. *P < 0,05 a fost obținut prin testul t Student. *P < 0,05 a fost obținut prin testul t Student. *P < 0,05 получено по t-критерию Стьюдента. *P < 0,05 prin testul t al lui Student. *P < 0,05 通过学生t 检验获得。 *P < 0,05 * P < 0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 obținut folosind testul t Student.
După confirmarea internalizării exozomilor derivați de BV2 în celulele de gliom U87, am efectuat teste de proliferare celulară pentru a investiga rolul exozomilor derivați de Toxoplasma BV2 în dezvoltarea celulelor gliomului uman.Tratamentul celulelor U87 cu exozomi din celulele BV2 infectate cu T. gondii a arătat că exozomii derivați din BV2 infectați cu T. gondii au provocat o proliferare semnificativ mai mare a celulelor U87 în comparație cu martor (Fig. 2B).
În plus, creșterea celulelor U118 a avut aceleași rezultate ca și U87, deoarece exozomii stimulați cu Toxoplasma au cauzat cele mai înalte niveluri de proliferare (datele nu sunt prezentate).Pe baza acestor date, putem indica că exozomii infectați cu Toxoplasmă derivați de BV2 joacă un rol important în proliferarea celulelor gliom.
Pentru a investiga efectul exozomilor derivați de BV2 infectați cu Toxoplasma asupra dezvoltării tumorii, am injectat celule de gliom U87 în șoareci nuzi pentru un model de xenogrefă și am injectat exozomi derivați de BV2 sau exozomi derivați de BV2 infectați cu RH.După ce tumorile au devenit evidente după 1 săptămână, fiecare grup experimental de 5 șoareci a fost împărțit în funcție de dimensiunea tumorii pentru a determina același punct de plecare, iar dimensiunea tumorii a fost măsurată timp de 22 de zile.
La șoarecii cu modelul de xenogrefă U87, au fost observate dimensiuni și greutate semnificativ mai mari a tumorii în grupul de exozomi infectați cu RH derivat de BV2 în ziua 22 (Fig. 3A, B).Pe de altă parte, nu a existat nicio diferență semnificativă în dimensiunea tumorii între grupul de exozomi derivati ​​din BV2 și grupul de control după tratamentul cu exozomi.În plus, șoarecii injectați cu celule de gliom și exozomi au afișat vizual cel mai mare volum tumoral din grupul de exozomi derivați de BV2 infectați cu RH (Fig. 3C).Aceste rezultate demonstrează că exozomii infectați cu Toxoplasmă derivați de BV2 induc creșterea gliomului într-un model de tumoră de șoarece.
Oncogeneza (AC) a exozomilor derivați de BV2 într-un model de șoarece cu xenogrefă U87.Dimensiunea (A) și greutatea (B) a tumorii au fost crescute semnificativ la șoarecii nuzi BALB/c tratați cu exozomi infectați cu RH derivați din BV2.Șoarecii nuzi BALB/c (C) au fost injectați subcutanat cu 1 x 107 celule U87 suspendate în amestec Matrigel.La șase zile după injectare, 100 μg de exozomi derivați de BV2 au fost tratați la șoareci.Dimensiunea și greutatea tumorii au fost măsurate în zilele indicate și, respectiv, după sacrificiu. *P < 0,05. *P < 0,05. *Р < 0,05. *P < 0,05. *P < 0,05. *P < 0,05. *Р < 0,05. *P < 0,05.
Datele au arătat că 37 de miARN (16 supraexprimate și 21 subexprimate) asociate cu imunitatea sau dezvoltarea tumorii au fost modificate semnificativ în microglia după infectarea cu tulpina Toxoplasma RH (Fig. 4A).Nivelurile relative de expresie ale miR-21 printre miARN-urile modificate au fost confirmate prin RT-PCR în timp real în exozomi derivați din BV2, exozomi tratați cu celule BV2 și U87.Expresia miR-21 a arătat o creștere semnificativă a exozomilor din celulele BV2 infectate cu Toxoplasma gondii (tulpina RH) (Fig. 4B).Nivelurile relative de expresie ale miR-21 în celulele BV2 și U87 au crescut după absorbția exozomilor modificați (Fig. 4B).Nivelurile relative ale expresiei miR-21 în țesuturile cerebrale ale pacienților cu tumori și ale șoarecilor infectați cu Toxoplasma gondii (tulpina ME49) au fost mai mari decât la martori, respectiv (Fig. 4C).Aceste rezultate se corelează cu diferențele dintre nivelurile de expresie ale microARN-urilor prezise și confirmate in vitro și in vivo.
Modificări în expresia miP-21a-5p exosomală în microglia infectată cu Toxoplasma gondii (RH).(A) Demonstrează modificări semnificative ale ARNsi asociate cu imunitatea sau dezvoltarea tumorii în urma infecției cu T. gondii RH.(B) Nivelurile relative de expresie miR-21 au fost detectate prin RT-PCR în timp real în exozomi derivați de BV2, exozomi tratați cu BV2 și celule U87.(C) Au fost găsite niveluri relative de expresie a miR-21 în țesuturile cerebrale ale pacienților cu tumori (N=3) și șoarecilor infectați cu Toxoplasma gondii (tulpina ME49) (N=3). *P < 0,05 a fost obținut prin testul t Student. *P < 0,05 a fost obținut prin testul t Student. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 a fost obținut utilizând testul t Student. *P < 0,05 通过学生t 检验获得。 *P < 0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 obținut folosind testul t Student.
Exozomii din celulele BV2 infectate cu RH au condus la creșterea glioamelor in vivo și in vitro (Fig. 2, 3).Pentru a detecta ARNm relevante, am examinat nivelurile de ARNm ale genelor țintă antitumorale, forkhead box O1 (FoxO1), PTEN și moartea celulară programată 4 (PDCD4) în celulele U87 infectate cu exozomi derivați din BV2 sau RH BV2.Analiza bioinformatică a arătat că mai multe gene asociate tumorilor, inclusiv genele FoxO1, PTEN și PDCD4, au site-uri de legare miR-2121,22.Nivelurile de ARNm ale genelor țintă antitumorale au fost reduse în exozomii derivați de BV2 infectați cu RH comparativ cu exozomii derivați de BV2 (Fig. 5A).FoxO1 a arătat niveluri reduse de proteine ​​în exozomii derivați de BV2 infectați cu RH în comparație cu exozomii derivați de BV2 (Figura 5B).Pe baza acestor rezultate, am putea confirma că exozomii derivați din BV2 infectat cu RH reduc genele anti-oncogene, menținându-și rolul în creșterea tumorii.
Exozomii derivați de BV2 infectați cu Toxoplasma RH induc suprimarea genelor antitumorale în celulele gliomului U87 de către exozomii derivați de BV2 infectați cu Toxoplasma RH.(A) PCR în timp real a expresiei FoxO1, PTEN și PDCD4 în exozomi derivați din BV2 infectat cu T. gondii RH în comparație cu exozomii PBS.ARNm de β-actină a fost utilizat ca martor.(B) Expresia FoxO1 a fost determinată prin Western blot și datele de densitometrie au fost evaluate statistic folosind programul ImageJ. *P < 0,05 a fost obținut prin testul t Student. *P < 0,05 a fost obținut prin testul t Student. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 a fost obținut utilizând testul t Student. *P < 0,05 通过学生t 检验获得。 *P < 0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 obținut folosind testul t Student.
Pentru a înțelege efectul miP-21 în exozomi asupra reglării genelor asociate tumorii, celulele U87 au fost transfectate cu un inhibitor al miP-21 utilizând Lipofectamine 2000 și celulele au fost recoltate la 24 de ore după transfecție.Nivelurile de expresie FoxO1 și p27 în celulele transfectate cu inhibitori miR-21 au fost comparate cu celulele tratate cu exozomi derivați de BV2 utilizând qRT-PCR (Fig. 6A, B).Transfecția inhibitorului miR-21 în celule U87 a redus semnificativ expresia FoxO1 și p27 (FIG. 6).
MiP-21 derivat din BV2 exosomal infectat cu RH a modificat expresia FoxO1/p27 în celulele de gliom U87.Celulele U87 au fost transfectate cu inhibitor de miP-21 folosind Lipofectamine 2000 și celulele au fost recoltate la 24 de ore după transfecție.Nivelurile de expresie FoxO1 și p27 în celulele transfectate cu inhibitori miR-21 au fost comparate cu nivelurile din celulele tratate cu exozomi derivați de BV2 utilizând qRT-PCR (A, B).
Pentru a scăpa de răspunsul imun al gazdei, parazitul Toxoplasma se transformă într-un chist tisular.Ei parazitează diverse țesuturi, inclusiv creierul, inima și mușchiul scheletic, pe toată durata de viață a gazdei și modulează răspunsul imun al gazdei.În plus, ele pot regla ciclul celular și apoptoza celulelor gazdă, promovând proliferarea acestora14,24.Toxoplasma gondii infectează predominant celulele dendritice gazdă, neutrofilele și linia monocite/macrofage, inclusiv microglia creierului.Toxoplasma gondii induce diferențierea macrofagelor fenotipului M2, afectează vindecarea rănilor după infecția cu patogen și este, de asemenea, asociată cu hipervascularizare și fibroză granulomatoasă.Această patogeneză comportamentală a infecției cu Toxoplasma poate fi legată de markeri asociați cu dezvoltarea tumorii.Mediul ostil reglementat de Toxoplasma poate să semene cu precancerul corespunzător.Prin urmare, se poate presupune că infecția cu Toxoplasma ar trebui să contribuie la dezvoltarea tumorilor cerebrale.De fapt, rate mari de infecție cu Toxoplasma au fost raportate în serul pacienților cu diferite tumori cerebrale.În plus, Toxoplasma gondii poate fi un alt efector cancerigen și acționează sinergic pentru a ajuta alți agenți cancerigeni infecțioși să dezvolte tumori cerebrale.În acest sens, este de remarcat faptul că P. falciparum și virusul Epstein-Barr contribuie sinergic la formarea limfomului Burkitt.
Rolul exosomilor ca regulatori în domeniul cercetării cancerului a fost investigat pe larg.Cu toate acestea, rolul exozomilor dintre paraziți și gazde infectate rămâne prost înțeles.Până acum, diverși regulatori, inclusiv proteinele secretate, au explicat procesele biologice prin care paraziții protozoare rezistă atacului gazdei și perpetuează infecția.Recent, a existat un concept în creștere conform căruia microveziculele asociate protozoarelor și microARN-urile lor interacționează cu celulele gazdă pentru a crea un mediu favorabil pentru supraviețuirea lor.Prin urmare, sunt necesare studii suplimentare pentru a descoperi relația dintre miARN-urile exosomale modificate și proliferarea celulelor gliom.Alterarea microARN (genele grupului miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 și miR-17-92) se leagă de promotorul STAT3 în macrofagele umane infectate cu toxoplasmă, este reglată și induce anti -apoptoza ca raspuns la infectia cu Toxoplasma gondii 29 .Infecția cu toxoplasmă crește expresia miR-17-5p și miR-106b-5p, care sunt asociate cu mai multe boli hiperproliferative 30 .Aceste date sugerează că miARN-urile gazdei reglementate de infecția cu Toxoplasma sunt molecule importante pentru supraviețuirea paraziților și patogeneza în comportamentul biologic al gazdei.
MiARN-urile modificate pot influența diferite tipuri de comportament în timpul inițierii și progresiei celulelor maligne, inclusiv glioame: autosuficiență a semnalelor de creștere, insensibilitate la semnalele de inhibare a creșterii, evaziunea apoptozei, potențial replicativ nelimitat, angiogeneză, invazie și metastază și inflamație.În gliom, miARN-urile modificate au fost identificate în mai multe studii de profilare a expresiei.
În studiul de față, am confirmat niveluri ridicate de expresie a miRNA-21 în celulele gazdă infectate cu toxoplasmă.miR-21 a fost identificat ca fiind unul dintre microARN-urile cel mai frecvent supraexprimate în tumorile solide, inclusiv glioamele, 33 și expresia sa se corelează cu gradul gliomului.Dovezile acumulate sugerează că miR-21 este o oncogenă nouă care acționează ca un factor anti-apoptotic în creșterea gliomului și este foarte supraexprimată în țesuturile și plasma tumorilor maligne ale creierului uman.Interesant este că inactivarea miR-21 în celulele și țesuturile gliomului declanșează inhibarea proliferării celulare din cauza apoptozei dependente de caspază.Analiza bioinformatică a țintelor prezise de miR-21 a dezvăluit mai multe gene supresoare tumorale asociate cu căile de apoptoză, inclusiv moartea celulară programată 4 (PDCD4), tropomiozină (TPM1), PTEN și cutia furcă O1 (FoxO1), cu site-ul de legare a miR-2121..22.38.
FoxO1, ca unul dintre factorii de transcripție (FoxO), este implicat în dezvoltarea diferitelor tipuri de cancer uman și poate regla expresia genelor supresoare tumorale, cum ar fi p21, p27, Bim și FasL40.FoxO1 poate lega și activa inhibitorii ciclului celular, cum ar fi p27, pentru a suprima creșterea celulară.Mai mult, FoxO1 este un efector cheie al semnalizării PI3K/Akt și reglează multe procese biologice, cum ar fi progresia ciclului celular și diferențierea celulară prin activarea transcripției p2742.
În concluzie, credem că miR-21 exosomal derivat din microglia infectată cu Toxoplasma poate juca un rol important ca regulator de creștere al celulelor gliom (Fig. 7).Cu toate acestea, sunt necesare studii suplimentare pentru a găsi o legătură directă între miR-21 exosomal, infecția alterată cu Toxoplasma și creșterea gliomului.Aceste rezultate sunt de așteptat să ofere un punct de plecare pentru studierea relației dintre infecția cu Toxoplasma și incidența gliomului.
În acest studiu este propusă o diagramă schematică a mecanismului carcinogenezei gliomului (creierului).Autorul desenează în PowerPoint 2019 (Microsoft, Redmond, WA).
Toate protocoalele experimentale din acest studiu, inclusiv utilizarea animalelor, au fost în conformitate cu Ghidurile etice standard ale Comitetului pentru Utilizatori și Îngrijirea Animalelor din cadrul Universității Naționale din Seul și au fost aprobate de Consiliul de Revizuire Instituțional al Școlii de Medicină a Universității Naționale din Seul (numărul IRB SNU- 150715).-2).Toate procedurile experimentale au fost efectuate în conformitate cu recomandările ARRIVE.
Microglia de șoarece BV2 și celulele de gliom uman U87 au fost cultivate în mediu Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Welgene, Seoul, Coreea) și, respectiv, mediu Roswell Park Memorial Institute (RPMI; Welgene), fiecare conținând 10% ser fetal bovin, 4 mM l- glutamină, penicilină 0,2 mM și streptomicina 0,05 mM.Celulele au fost cultivate într-un incubator cu 5% CO2 la 37°C.O altă linie celulară de gliom, U118, a fost utilizată pentru comparație cu celulele U87.
Pentru a izola exozomii din tulpinile RH și ME49 infectate cu T. gondii, tahizoiții de T. gondii (tulpina RH) au fost recoltați din cavitatea abdominală a șoarecilor BALB/c de 6 săptămâni injectați cu 3-4 zile înainte.Tahizoiții au fost spălați de trei ori cu PBS și purificați prin centrifugare în Percoll 40% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA)43.Pentru a obține tahizoiți din tulpina ME49, șoarecii BALB/c au fost injectați intraperitoneal cu 20 de chisturi tisulare și transformarea tahizoiților în chisturi a fost colectată prin spălarea cavității abdominale în a 6-a zi după infecție (PI).Șoareci infectați cu PBS.Tahizoiții ME49 au fost cultivați în celule suplimentate cu 100 μg/ml penicilină (Gibco/BRL, Grand Island, NY, SUA), 100 μg/ml streptomicina (Gibco/BRL) și 5% ser fetal bovin (Lonza, Walkersville, MD) .., SUA) la 37 °C și 5% dioxid de carbon.După cultivarea în celule Vero, tahizoiții ME49 au fost trecuți de două ori printr-un ac de calibrul 25 și apoi printr-un filtru de 5 um pentru a îndepărta resturile și celulele.După spălare, tahizoiții au fost resuspendați în PBS44.Chisturile tisulare ale tulpinii ME49 de Toxoplasma gondii au fost menținute prin injectarea intraperitoneală de chisturi izolate din creierul șoarecilor C57BL/6 infectați (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Coreea).Creierele șoarecilor infectați cu ME49 au fost recoltate după 3 luni de PI și tocate la microscop pentru a izola chisturile.Șoarecii infectați au fost ținuți în condiții speciale fără agenți patogeni (SPF) la Școala Națională de Medicină a Universității Naționale din Seul.
ARN-ul total a fost extras din exozomi, celule BV2 și țesuturi derivați de BV2 folosind kitul miRNeasy Mini (Qiagen, Hilden, Germania) conform instrucțiunilor producătorului, inclusiv timpul de incubare pentru etapa de eluare.Concentrația de ARN a fost determinată pe un spectrofotometru NanoDrop 2000.Calitatea micromatricelor ARN a fost evaluată folosind un bioanalizator Agilent 2100 (Agilent Technologies, Amstelveen, Olanda).
DMEM cu 10% FBS sărac în exozomi a fost preparat prin ultracentrifugare la 100.000 g timp de 16 ore la 4°C și filtrat printr-un filtru de 0,22 um (Nalgene, Rochester, NY, SUA).Celulele BV2, 5 × 105, au fost cultivate în DMEM care conține 10% FBS epuizat în exozomi și 1% antibiotice la 37°C și 5% CO2.După 24 de ore de incubare, tahizoiții din tulpina RH sau ME49 (MOI = 10) au fost adăugați la celule și paraziții neinvazitori au fost îndepărtați în decurs de o oră și reumpluți cu DMEM.Exozomii din celulele BV2 au fost izolați prin centrifugare diferențială modificată, metoda cea mai utilizată.Resuspendați peletul de exozom în 300 ui PBS pentru analiza ARN sau a proteinei.Concentrația de exozomi izolați a fost determinată folosind un kit de analiză a proteinei BCA (Pierce, Rockford, IL, SUA) și un spectrofotometru NanoDrop 2000.
Precipitatele din celulele BV2 sau exozomii derivați din BV2 au fost lizate în soluție de extracție a proteinei PRO-PREP™ (iNtRon Biotechnology, Seongnam, Coreea) și proteinele au fost încărcate pe geluri de poliacrilamidă SDS 10% colorate cu albastru strălucitor Coomassie.În plus, proteinele au fost transferate pe membranele PVDF timp de 2 ore.Western blot au fost validate folosind anticorpul Alix (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, SUA) ca marker exosomal.IgG anti-șoarece de capră conjugată cu HRP (H + L) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, SUA) și un analizor de imagine luminiscent LAS-1000 plus (Fuji Photographic Film, Tokyo, Japonia) au fost utilizate ca anticorp secundar..Microscopia electronică cu transmisie a fost efectuată pentru a studia dimensiunea și morfologia exozomilor.Exozomi izolați din celulele BV2 (6,40 pg/pl) au fost preparați pe ochiuri acoperite cu carbon și colorați negativ cu 2% acetat de uranil timp de 1 min.Probele preparate au fost observate la o tensiune de accelerare de 80 kV folosind un JEOL 1200-EX II (Tokyo, Japonia) echipat cu o cameră CCD ES1000W Erlangshen (Gatan, Pleasanton, CA, SUA).
Exozomii derivați de BV2 au fost colorați folosind kitul PKH26 Red Fluorescent Linker (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA) timp de 15 minute la temperatura camerei.Celulele U87, 2x105, cu exozomi marcați cu PKH26 (roșu) sau fără exozomi ca martor negativ, au fost incubate la 37°C timp de 24 de ore într-un incubator cu 5% CO2.Nucleele celulelor U87 au fost colorate cu DAPI (albastru), celulele U87 au fost fixate în paraformaldehidă 4% timp de 15 minute la 4°C și apoi analizate într-un sistem de microscop confocal Leica TCS SP8 STED CW (Leica Microsystems, Mannheim, Germania).observabil.
cADN-ul a fost sintetizat din siARN utilizând sinteza primei catene Mir-X siRNA și kitul SYBR qRT-PCR (Takara Bio Inc., Shiga, Japonia).PCR cantitativă în timp real a fost efectuată utilizând sistemul de detecție PCR în timp real iQ5 (Bio-Rad, Hercules, CA, SUA) folosind primeri și șabloane amestecate cu SYBR Premix.ADN-ul a fost amplificat pentru 40 de cicluri de denaturare la 95°C timp de 15 s și recoacere la 60°C timp de 60 s.Datele din fiecare reacție PCR au fost analizate utilizând modulul de analiză a datelor al software-ului sistemului optic iQ™5 (Bio-Rad).Modificările relative ale expresiei genelor între genele țintă selectate și β-actină/siARN (și U6) au fost calculate folosind metoda curbei standard.Secvențele de primer utilizate sunt prezentate în Tabelul 1.
3 x 104 celule de gliom U87 au fost însămânțate în plăci cu 96 de godeuri și amestecate cu exozomi infectați cu Toxoplasma derivați din BV2 (50 μg/mL) sau exozomi fără puls derivați din BV2 (50 μg/mL) ca martori la 12, 18 și 36 de ore .Rata de proliferare celulară a fost determinată utilizând Kit-ul de numărare a celulelor-8 (Dojindo, Kumamoto, Japonia) (Figurile suplimentare S1-S3) 46.
Femele de șoareci nuzi BALB/c în vârstă de 5 săptămâni au fost achiziționate de la Orient Bio (Seongnam-si, Coreea de Sud) și ținute individual în cuști sterile la temperatura camerei (22±2°C) și umiditate (45±15°C).%) la temperatura camerei (22±2°C) și umiditate (45±15%).Un ciclu de lumină de 12 ore și un ciclu de întuneric de 12 ore au fost efectuate sub SPF (Seoul National University School of Medicine Animal Center).Șoarecii au fost împărțiți aleatoriu în trei grupuri de câte 5 șoareci fiecare și toate grupurile au fost injectate subcutanat cu 400 ml de PBS care conținea 1 x 107 celule de gliom U87 și BD Matrigel™ cu factor de creștere redus (BD Science, Miami, FL, SUA).La șase zile după injectarea tumorii, 200 mg de exozomi derivați din celulele BV2 (cu/fără infecție cu Toxoplasma) au fost injectați în locul tumorii.La douăzeci și două de zile după infectarea tumorii, dimensiunea tumorii șoarecilor din fiecare grup a fost măsurată cu un șubler de trei ori pe săptămână, iar volumul tumorii a fost calculat prin formula: 0,5 x (lățime) x 2 x lungime.
Analiza exprimării microARN folosind matrice miRCURYTM LNA, a 7-a generație are, matrice mmu și rno (EXIQON, Vedbaek, Danemarca) care acoperă 1119 șoareci bine caracterizați dintre 3100 de sonde de captură miARN umane, șoarece și șobolan.În timpul acestei proceduri, 250 până la 1000 ng de ARN total au fost îndepărtați din 5′-fosfat prin tratament cu fosfatază alcalină intestinală de vițel urmat de marcare cu colorant fluorescent verde Hy3.Probele etichetate au fost apoi hibridizate prin încărcarea diapozitivelor cu microarray folosind un kit de cameră de hibridizare (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, SUA) și un kit de lame de hibridizare (Agilent Technologies).Hibridizarea a fost efectuată timp de 16 ore la 56°C, apoi micromatricele au fost spălate în conformitate cu recomandările producătorului.Diapozitivele microarray procesate au fost apoi scanate folosind un sistem de scanare cu microarray Agilent G2565CA (Agilent Technologies).Imaginile scanate au fost importate folosind software-ul Agilent Feature Extraction versiunea 10.7.3.1 (Agilent Technologies) și intensitatea fluorescenței fiecărei imagini a fost cuantificată folosind fișierul GAL corespunzător al protocolului Exiqon modificat.Datele de microarray pentru studiul curent sunt depozitate în baza de date GEO sub numărul de acces GPL32397.
Profilurile de expresie ale miARN-urilor exosomale mature în microglia ale tulpinilor RH sau ME49 infectate cu Toxoplasma au fost analizate folosind diverse instrumente de rețea.miRNA-urile asociate cu dezvoltarea tumorii au fost identificate folosind miRWalk2.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) și filtrate cu intensitatea semnalului normalizat (log2) mai mare de 8,0.Printre miARN, miARN-urile exprimate diferențial s-au dovedit a fi modificate de mai mult de 1,5 ori prin analiza filtrului miARN modificate de tulpinile RH sau ME49 infectate cu T. gondii.
Celulele au fost însămânțate în plăci cu șase godeuri (3 x 105 celule/godeu) în opti-MEM (Gibco, Carlsbad, CA, SUA) utilizând Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA).Celulele transfectate au fost cultivate timp de 6 ore și apoi mediul a fost schimbat în mediu complet proaspăt.Celulele au fost recoltate la 24 de ore după transfecție.
Analiza statistică a fost efectuată în principal folosind testul t Student cu software Excel (Microsoft, Washington, DC, SUA).Pentru analiza experimentală pe animale, a fost efectuată o ANOVA bidirecțională folosind software-ul Prism 3.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, SUA). Valorile p < 0,05 au fost considerate semnificative statistic. Valorile p < 0,05 au fost considerate semnificative statistic. Значения P <0,05 считались статистически значимыми. Valorile p <0,05 au fost considerate semnificative statistic. P 值< 0,05 被认为具有统计学意义。 P 值< 0,05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. Valorile p <0,05 au fost considerate semnificative statistic.
Toate protocoalele experimentale utilizate în acest studiu au fost aprobate de Consiliul de revizuire instituțional al Școlii Naționale de Medicină a Universității Naționale din Seul (număr IRB SNU-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Furley, J. şi colab.Incidența și mortalitatea globală estimată prin cancer în 2018: surse și metode GLOBOCAN.Interpretare.J. Ruck 144, 1941–1953 (2019).
Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS O perspectivă asupra factorilor de risc ai tumorilor cerebrale și a intervențiilor lor terapeutice. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS O perspectivă asupra factorilor de risc ai tumorilor cerebrale și a intervențiilor lor terapeutice.Rashid, S., Rehman, K. și Akash, MS O revizuire a factorilor de risc pentru tumorile cerebrale și intervențiile terapeutice majore. Rasheed, S., Rehman, K. și Akash, MS 深入了解脑肿瘤的危险因素及其治疗干预措施。 Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Înțelegerea profundă a factorilor de risc pentru tumorile cerebrale și a intervențiilor terapeutice.Rashid, S., Rehman, K. și Akash, MS O revizuire a factorilor de risc pentru tumorile cerebrale și intervențiile terapeutice majore.Stiinta biomedicala.Farmacist.143, 112119 (2021).
Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Interacțiuni bacteriene-virale în cancerele orodigestive umane și ale tractului genital feminin: un rezumat al dovezilor epidemiologice și de laborator. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Interacțiuni bacteriene-virale în cancerele orodigestive umane și ale tractului genital feminin: un rezumat al dovezilor epidemiologice și de laborator.Kato I., Zhang J. și Sun J. Interacțiuni bacteriene-virale în cancerul tractului gastrointestinal uman și tractului genital feminin: un rezumat al datelor epidemiologice și de laborator. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J.总结。 Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Interacțiunea bacterio-virală în digestia cavității bucale umane și tractul reproducător feminin: rezumatul științei bolilor populare și dovezilor de laborator.Kato I., Zhang J. și Sun J. Interacțiuni bacteriene-virale în cancerul gastrointestinal uman și cancerul genital feminin: un rezumat al datelor epidemiologice și de laborator.Cancer 14, 425 (2022).
Magon, KL & Parish, JL De la infecție la cancer: Cum virușii tumorali ADN modifică metabolismul central al carbonului și al lipidelor celulei gazdă. Magon, KL & Parish, JL De la infecție la cancer: Cum virușii tumorali ADN modifică metabolismul central al carbonului și al lipidelor celulei gazdă.Mahon, KL și Parish, JL Infecția cu foc la cancer: cum virușii tumorali bazați pe ADN modifică metabolismul central al carbonului și al lipidelor celulei gazdă. Magon, KL & Parish, JL 从感染到癌症：DNA 肿瘤病毒如何改变宿主细胞的中心碳和脂质䣂谢 Magon, KL & Parish, JL De la infecție la cancer: cum virușii tumorali ADN modifică metabolismul central al carbonului și al lipidelor celulei gazdă.Mahon, KL și Parish, JL Incendiază infecția la cancer: cum virușii tumorali ADN modifică metabolismul central al carbonului și al lipidelor în celulele gazdă.Biologie deschisă.11, 210004 (2021).
Correia da Costa, JM et al.Estrogeni catecol ai schistozomilor și ai ficatului și cancerului asociat cu helminți.față.fierbinte înăuntru.5, 444 (2014).